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瓜类枯萎病研究进展 王卿 林玲摘要：枯萎病又称蔓割病、萎凋病，是瓜类作物上最主要的病害之一，一直是国内外研究的热点该病是由尖孢镰刀菌侵染引起的一种土传、种传维管束病害，防治困难且病原菌具有寄主专化性，在全球大部分的瓜类产区均有发生，给我国及世界各国的农业生产造成了巨大的经济损失本文结合最新的研究内容，对瓜类枯萎病病原菌寄主专化型、病原菌全基因组测序与致病机制、病原菌分子检测、寄主抗病分子机制以及病害防治措施进行了概述，并对今后的研究方向进行展望关键词：瓜类枯萎病；寄主转化型；致病机制；抗病机制；检测及防治措施Research progress on Fusarium wilt of cucurbitsWANG Qing，LIN Ling（Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China）Abstract：Fusarium wilt caused by different formae speciales of the fungus Fusarium oxysporum is one of the main diseases on the Cucurbitaceae plant family. This soil-borne and seed-borne vasular disease is difficult to control. It occured in the cucurbit production areas around the world and caused enormous economy loss in China and other countries. This paper summarized the latest research progresses of the formae speciales， genome sequence，pathogenesis mechanism and molecu？ lar detection of the pathogen， molecular mechanism of disease resistance in cucurbits as well as the control methods of this disease，and the future research was also prospected.Key words：Cucurbits Fusarium wilt；Formae speciales；Pathogenesis mechanism；Disease resistance；Detection and con？ trol method瓜类枯萎病（Fusarium wilt）又称萎蔫病，是由不同专化型的尖孢镰刀菌引起的一种土传病害，主要危害西瓜、黄瓜、甜瓜、苦瓜等瓜类作物，该病在除南极洲以外的各大洲均有发生。

目前，瓜类枯萎病在国内瓜类主栽区普遍发生，成为严重制约瓜类蔬菜产业发展的重要因素不同瓜类枯萎病致病菌的生态学特征、侵染过程及防治方法很相似尖孢镰刀菌不断进化出新的生理小种，并且其厚垣孢子能够长期在土壤中存活，使得枯萎病的防治十分困难[1]本文根据国内外瓜类枯萎病的研究成果，对瓜类枯萎病病原菌的寄主专化型、全基因组测序、致病机制、分子检测技术，以及寄主抗病机制和病害防治方法进行了总结概述1病原菌寄主专化型瓜类枯萎病主要由子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）丛赤壳科（Nectriaceae）镰孢菌属（Fusarium）的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起，瓜类枯萎病致病菌至少存在8个专化型[2]，分别为：尖孢镰刀菌西瓜专化型（F. oxysporum f. sp. niveum）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）、尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporum f. sp. melonis）、尖孢镰刀菌丝瓜专化型（F. oxysporum f. sp. luffae）、尖孢镰刀菌葫芦专化型（F. oxysporum f. sp. lagenariae）、尖孢镰刀菌苦瓜专化型（F. oxysporum f. sp. momordicae）、尖孢镰刀菌冬瓜专化型（F. oxysporum f. sp. beninca？ sae）、尖孢镰刀菌瓜类专化型（F. oxysporum f. sp. cu？ curbitacearum）。

这些不同专化型的尖孢镰刀菌在形态上没有明显差异，但是对同科不同属寄主植物的致病力不同在同一专化型的尖孢镰刀菌中，又根据对寄主植物同属的不同品种致病力的差异，划分为许多生理小种截至目前，国际报道的西瓜枯萎专化型有4个生理小种：0、1、2和3[3]；甜瓜枯萎专化型有4个生理小种，即生理小种0号、1号、2号和1.2号，根据生理小种1.2号引起病害症状的差异，又将其分为1.2w和1.2y[4]；黄瓜枯萎专化型划分为生理小种1号、2号、3号和4号[5]2病原菌全基因组测序与致病机制2010年Ma等[6]完成了尖孢镰刀菌的基因组测序，这为从比较基因组、功能基因组、蛋白质组方面全面分析其致病性、致病因子等相关的信息提供了基础该研究表明尖孢镰刀菌基因组的种系特异性（LS）序列包含4个同源染色体，占据了整个基因组的四分之一，LS区域富含转座子和与致病性有关且有进化痕迹的基因，通过共培养，使不同尖孢镰刀菌中2个LS染色体发生自发的水平转移，就可将一个非致病菌株转变为致病菌株，导致新的致病家族快速出现，这些发现为人们了解致病性的演化提供了线索一般来讲，尖孢镰刀菌致病需经过菌丝生长、侵染、定殖及扩展瓜类作物最初的侵染来自土壤中越冬的厚垣孢子，厚垣孢子萌发产生侵染性的菌丝，菌丝可侵染寄主根部尤其是侧根或者受伤的根部，并在根部表皮细胞黏附、生长；接着，病原菌可穿过寄主根部皮层逐渐到达木质部维管束，产生更多的菌丝及分生孢子，并随蒸腾作用向上运动、阻塞维管束。

整个侵染过程中，病原菌都要克服植物防御应答，在侵染的最后阶段，病原菌分泌细胞溶解酶和毒素，引起植物发病症状，包括坏死和萎蔫[7]通过对病原菌进行绿色荧光蛋白GFP标记的方法，可研究病原菌在植物体内的侵染动态Zvirin[8]等对甜瓜生理小种1.2进行GFP标记，研究了其在感病品种‘Ein Dor和抗病品种‘BIZ中的定殖动态，并发现病原菌对寄主侵染的速度与寄主的抗性有关，对感病品种的侵染速度明显快于抗病品种；另外，有研究表明，病原菌在植物体内定殖的数量与寄主的发病情况成正相关，对病原菌进行绿色荧光蛋白GFP标记并侵染寄主，发现植株中病原菌的荧光强度越强，其病害越严重[9]目前，人们对尖孢镰刀菌的致病因子进行了大量的分子生物学研究甜瓜枯萎病菌中fow1编码线粒体载体蛋白的致病相关基因，与尖孢镰刀菌在宿主中的定殖密切相关，fow1缺失突变体不能在甜瓜组织中定殖从而减弱了对寄主的侵染能力[10]； fow2编码Zn（Ⅱ）2Cys6家族中一个锌指双核簇状DNA结合区，是病菌侵入甜瓜根部并在其组织内定殖的关键基因[11]编码尖孢镰刀菌黄瓜专化型磷脂酶C的FoPLC4在调控病菌的分生孢子形成和致病性中发挥重要作用，在相同条件下，突变体？Fo？ PLC4不但可产生和野生型菌株一样的小型分生孢子，还可产生大型分生孢子，且产孢量下降了82.2 %；在致病力测定中，？FoPLC4与野生型相比，导致的黄瓜萎蔫症状明显减轻[12]。

基因FoCdk8、FoCycc、Fomed19和Fomed10均参与调控西瓜枯萎病菌的生长发育、产孢、孢子萌发及致病性等方面，4个基因敲除的突变体菌丝受不同程度抑制，菌丝生长缓慢，孢子产量显著下降，分生孢子萌发缓慢，萌发率显著下降，致病力也不同程度下降甚至完全丧失[13]3病原菌的分子检测鉴定枯萎病菌的早期检测及诊断对枯萎病的防治有着重要意义，然而传统的病原菌鉴定方法需观察植株发病症状、分离病原菌、鉴定寄主致病性，该方法耗时较长，灵敏度较低，经验性较强，不利于病害发生的有效控制随着现代分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）、巢式PCR（nested PCR）、实时定量PCR（Real-time PCR）以及限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA标记（RAPD）等技术可以用于快速准确的检测出病原菌，对病原菌进行早期预警诊断，有效地控制病原菌的传播与病害流行张淑梅等[14]根据真菌核糖体转录间隔区（ITS）序列具有种内稳定性和种间高度变异性的特点，对黄瓜、西瓜和甜瓜枯萎病菌ITS序列设计了1对特异性引物，建立了瓜类枯萎病菌一步PCR分子检测体系，可在症状出现前约7 d检测到3种寄主枯萎病菌；该方法成本低、耗时短、污染小、实用性较强。

Zhang等[15]根据镰刀菌属ITS区设计了特异性引物Fn-1和Fn-2，用常规PCR方法检测西瓜枯萎病菌时，基因组的灵敏度为1 fg，将该特异性引物联合通用引物（ITS1/ITS2）利用nested PCR检测西瓜枯萎病菌时，其灵敏度可提高1 000倍PCR-RFLP、nested PCR、Real-time PCR的方法都可在瓜类没有明显症状时检测出中尖孢镰刀菌，都具有灵敏高、特异性强的特点陈微等[16]利用PCR-RFLP和nested PCR2种方法检测黄瓜枯萎病菌，认为PCR-RFLP的灵敏度比nested PCR高，2种方法分别于接种病菌3 d和5 d时检测出黄瓜枯萎病菌，但nested PCR特异性更好，方法简便，更适合于黄瓜枯萎病菌的实际检测Real-time PCR方法污染少、成本低、特异性和灵敏性较好，Kelly等[17]利用Real-time PCR可以准确鉴定并定量黄瓜枯萎病专化型菌株；赵爽等[18]应用基因宏阵列（Macroar？ ray）技术对土壤中尖孢镰刀菌进行快速监测，并应用Real-time PCR对发病土壤中西瓜枯萎病菌的数量进行了绝对定量RAPD也是病原真菌检测中的重要分子方法，Lin等[19]利用RAPD分析，设计了特异性引物Fon-1/Fon-2和FnSc-1/FnSc-2，能够区分Fon和Fo，而且灵敏度较高，当Fon的DNA浓度低至0.01 pg时仍可检测到。

Rubn[20]等基于由RAPD演化而来的特定序列扩增区段标记（SCAR）技术，建立了Real-time PCR的方法，可在甜瓜无明显症状时对甜瓜枯萎病菌进行检测和定量；利用该方法在病原菌接种48 h时就可将其检测到4寄主抗病分子机制瓜类寄主对枯萎病菌侵染后的反应是全方位多方面的，寄主在胁迫条件下的整体反应表现为初级代谢的改变，受到病原菌侵染后会开启和增强自身抗性相关基因的表达，并形成与抗病相关的产物，从而表现出不同程度的抗病性和免疫性[21]黄瓜的基因组已被测序，在黄瓜抗枯萎病相关基因研究上，用比较基因组学的方法分析抗病基因同源序列（RGA）与已定位抗病基因的关系，为新抗病基因的发现提供了捷径沈凤瑞等[22]以黄瓜抗枯萎病材料‘Cu14为试材，采用基因差异显示技术（DDRT-PCR）研究了黄瓜枯萎病抗性相关基因，获得差异片段A178-2，通过BLAST比对发现该基因片段的328个核苷酸中有145个核苷酸与拟南芥泛素蛋白同源，可能与胁迫反应、免疫应答等有关西瓜抗枯萎病基因方面的研究还相对比较缓慢，西瓜种质‘PI296341根部组织全长cDNA库的建立，为新的西瓜枯萎病抗病基因的筛选和克隆提供了条件；对西瓜进行枯萎病菌接种，并用实时定量PCR监测，结果显示接种西瓜12 h。