细胞生物学技术1课件.ppt

第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法Chapter 3 Chapter 3 Techniques in Cell BiologyTechniques in Cell Biology第一节第一节 显微技术显微技术细胞生物学的建立和发展得益于光学显细胞生物学的建立和发展得益于光学显微镜的发明；微镜的发明；电子显微镜的发明使对细胞结构和功能电子显微镜的发明使对细胞结构和功能的研究达到了新的水平的研究达到了新的水平光学显微镜与电子显微镜的主要差别光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大：差非常大：光学显微镜的最大分辨率：光学显微镜的最大分辨率：0.2μm0.2μm电子显微镜的分辨率：电子显微镜的分辨率：0.2nm0.2nm一、显微镜的成像原理一、显微镜的成像原理所有类型的显微镜，镜像的形成都需要所有类型的显微镜，镜像的形成都需要3 3个基本要素：个基本要素： 1 1、照明系统；、照明系统； 2 2、被观察的物品；、被观察的物品； 3 3、聚焦成像的透镜系统、聚焦成像的透镜系统照明系统的波长是显微镜成像的重照明系统的波长是显微镜成像的重要因素，因为波长能决定被检测物要因素，因为波长能决定被检测物体的最小极限，波长越长，波幅的体的最小极限，波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到物体的极跨度就越大，所能观察到物体的极限就越大。

限就越大1 1、分辨率（、分辨率（ResolutionResolution））是指能分辨出相邻两个物点间的最是指能分辨出相邻两个物点间的最小距离的能力小距离的能力一般规定：显微镜或人眼在一般规定：显微镜或人眼在25cm25cm明明视距离处，能清楚分辨被检物体细视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称分辨率微结构最小间隔的能力，称分辨率分辨力可用公式计算：分辨力可用公式计算：R=0.61λ /N.A.R=0.61λ /N.A. N.A.N.A.＝ｎ＝ｎsinαsinα式中：式中： λ = λ =波长；波长；n=n=介质折射率；介质折射率；α=α=镜口角镜口角（标本对物镜镜口张角的（标本对物镜镜口张角的1/21/2），），N.A.=N.A.=镜口率镜口率（（numeric aperturenumeric aperture）镜口角总是要小于）镜口角总是要小于9090˚，，sin α sin α 的最大值小于的最大值小于1 1不同光源的波长不同光源的波长名称可见光紫外光X射线α射线电子束0.1Kv10Kv波 长(nm)450-76013~3900.05~130.005~10.1230.01222 2、最大分辨率、最大分辨率R R值越小，分辨率越高，即需要值越小，分辨率越高，即需要λλ尽可能尽可能地小，和地小，和N.A.N.A.尽可能大。

尽可能大可见光中以蓝光波长最短，可见光中以蓝光波长最短， λ=450nmλ=450nm；；目前最好的玻璃透镜的目前最好的玻璃透镜的α=70 α=70 ˚ ，， sin α sin α =0.94;=0.94;空气的折射率空气的折射率n n≈1≈1；；所以所以光镜的最大分辨率光镜的最大分辨率：： R=450/1*0.94=R=450/1*0.94=292nm292nm= =0.3μm0.3μm3 3、分辨极限与放大率、分辨极限与放大率显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限最终成像的大小与原物体大小的比值称最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率（为放大率（magnificationmagnification）总放大率总放大率= =物镜的放大率物镜的放大率* *目镜放大率目镜放大率放大率受分辨极限的限制一般，光学放大率受分辨极限的限制一般，光学显微镜的最大放大率只能是数值孔镜显微镜的最大放大率只能是数值孔镜（（N.A.N.A.）的）的10001000倍二、光学显微镜二、光学显微镜（一）、普通双目显微镜（一）、普通双目显微镜* *照明系统：可见光源照明系统：可见光源* *光学放大系统：由物镜和目镜组成，都光学放大系统：由物镜和目镜组成，都是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4 4个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜镜* *机械和支架系统：保证光学系统的准确机械和支架系统：保证光学系统的准确配制和灵活调控配制和灵活调控 1. The Light Microscopy1. The Light Microscopy（（LMLM））光镜观察样本的制备光镜观察样本的制备 石蜡切片石蜡切片.2 2、倒置显微镜、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在载物台之下，倒置显微镜在载物台之载物台之下，倒置显微镜在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

差物镜3 3、暗视野显微镜、暗视野显微镜（（dark field microscopedark field microscope）） 聚光镜中央有挡光片，使照明光线聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的是黑的，物体的边缘是亮的 能观察能观察 4~200nm 4~200nm的微粒子，分辨率的微粒子，分辨率可比普通显微镜高可比普通显微镜高5050倍4 4、荧光显微镜、荧光显微镜 是对能发荧光的物质进行定性和定是对能发荧光的物质进行定性和定量研究的工具量研究的工具 细胞中有些物质如叶绿素等，受紫细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；外线照射后可发荧光； 有些物质本身虽不能发荧光，但用有些物质本身虽不能发荧光，但用荧光染料染色，紫外线照射也发荧光荧光染料染色，紫外线照射也发荧光 荧光显微镜和普通显微镜区别：荧光显微镜和普通显微镜区别：1 1、照明方式通常为落射式，即光源通过、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；物镜投射于样品上；2 2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；于普通显微镜；3 3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

除紫外线，用以保护人目5 5、激光共聚焦扫描显微境、激光共聚焦扫描显微境（（laser confocal scanning laser confocal scanning microscopemicroscope））* *用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点 *调焦一次，扫描限制在样品一个平面调焦深度调焦一次，扫描限制在样品一个平面调焦深度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，能显示样品的立体结构能显示样品的立体结构 *激光波长短，光束细，分辨率是光镜的激光波长短，光束细，分辨率是光镜的3 3倍Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. 6 6、相差显微镜、相差显微镜（（phase-contrast phase-contrast microscopemicroscope）） 由由ZernikeZernike于于19321932年发明，并因此获年发明，并因此获19531953年诺贝尔物理奖。

年诺贝尔物理奖 最大的特点是可以观察未经染色的最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞标本和活细胞 基本原理：把透过标本的可见光的基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而提光程差变成振幅差（明暗差），从而提高了各种结构间的对比度，使结构变得高了各种结构间的对比度，使结构变得清晰可见清晰可见 光线透过标本后发生折射，偏离了光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了原来的光路，同时被延迟了1/4λ1/4λ，如再，如再增加或减少增加或减少1/4λ1/4λ，则光程差变为，则光程差变为1/2λ1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差减小，提高反差构造上，相差显微镜不同于光镜之处：构造上，相差显微镜不同于光镜之处：1 1、环形光阑（、环形光阑（annular  diaphragmannular  diaphragm）） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上的光线形成空心光锥，焦聚到标本上2 2、相位板（、相位板（annular phaseplateannular phaseplate））在物在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟射光或衍射光的相位推迟1/4λ1/4λ。

Figure 3-2. Figure 3-2. Interference between light waves. Interference between light waves. When When two light waves combine two light waves combine in phase,in phase, the amplitude of the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are increased. Two light waves that are out of phaseout of phase partially cancel each other and produce a wave partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. decreased. 7 7、微分干涉显微镜、微分干涉显微镜（（differential-interference differential-interference microscopemicroscope）） 1952 1952年，年，NomarskiNomarski在相差显微镜在相差显微镜原理的基础上发明。

原理的基础上发明 优点是能显示结构的三维立体投影优点是能显示结构的三维立体投影影像与相差显微镜相比，标本可略厚，影像与相差显微镜相比，标本可略厚，折射率差别更大，故影像立体感更强折射率差别更大，故影像立体感更强图图2-10 DIC显微镜显微镜下的硅藻下的硅藻（伪彩色）（伪彩色）DICDIC显微镜使细胞的结构，特别是一些显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作目前体感特别强，适合于显微操作目前像基因注入、核移植、转基因等的显像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行微操作常在这种显微镜下进行四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较：四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜； (B) 相差显微镜； (C) 微分干涉显微镜； (D) 暗视野显微镜二、电子显微镜二、电子显微镜 光学显微镜受照射光波长的限制，在光学显微镜受照射光波长的限制，在可见光下其分辨极限只有可见光下其分辨极限只有0.2μm0.2μm，即使在，即使在紫外光下，最大分辨率也只有紫外光下，最大分辨率也只有0.1 μm0.1 μm，，要观察更精细的结构，只有借助分辨率更要观察更精细的结构，只有借助分辨率更高的电子显微镜。

高的电子显微镜（一）透射电子显微镜（一）透射电子显微镜(transmission electron (transmission electron microscopemicroscope，，TEM)TEM)•Ruska 1932Ruska 1932年发明•以电子束为光源，波长比可见光和紫外以电子束为光源，波长比可见光和紫外光短得多，且电子束的波长与发射电子束光短得多，且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比的电压平方根成反比•最大分辨率最大分辨率达达0.2nm0.2nm1 1、透射电镜的结构、透射电镜的结构由由5 5部分组成：部分组成：1 1、电子照明系统、电子照明系统：电子枪；：电子枪；2 2、真空系统、真空系统：用真空泵和油扩散泵获得：用真空泵和油扩散泵获得高真空；高真空；3 3、电磁透镜成像系统、电磁透镜成像系统：规范电子的行为；：规范电子的行为；4 4、记录系统、记录系统：用荧光屏观察影像，用照：用荧光屏观察影像，用照相系统记录影象；相系统记录影象；5 5、电源系统、电源系统：提供高压稳压提供高压稳压2 2、电镜制样技术、电镜制样技术（（1）超微切片技术）超微切片技术石蜡切片: 3-10um; 超薄切片: 40-50nmSections of LM: >5um;Sections of TEM: <100nm  由于电子束的穿透力很弱，因由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约此用于电镜的标本须制成厚度约50nm50nm左右的超薄切片。

这种切片需左右的超薄切片这种切片需要用超薄切片机要用超薄切片机（（ultramicrotomeultramicrotome）制作Thin sectionscopper grid used to support the thin sections of copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron a specimen in the transmission electron microscope. microscope.  Specimen Preparation for Electron Microscopy Two common chemical fixatives used for electron microscopy. The two reactive aldehyde groups of glutaraldehyde enable it to cross-link various types of molecules, forming covalent bonds between them. Osmium tetroxide is reduced by many organic compounds with which it forms cross-linked complexes. It is especially useful for fixing cell membranes, since it reacts with the C=C double bonds present in many fatty acids. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. 通过连续切片达通过连续切片达到被检样品的三到被检样品的三维结构的重构维结构的重构 （（2 2）负染色技术）负染色技术 负染是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双负染是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色； 吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，呈负染效果，分辨力可达料沉积，呈负染效果，分辨力可达1.5nm1.5nm。

经负染的肌动蛋白纤维经负染的肌动蛋白纤维(3)(3)冰冻蚀刻冰冻蚀刻(freeze-etching)(freeze-etching) 样样本本置置-196-196˚C C液液氮氮中中冰冰冻冻然然后后用用冷冷刀刀骤骤然然将将标标本本断断开开，，冰冰在在真真空空下下迅迅速速升升华华，，暴露出断面结构，称蚀刻暴露出断面结构，称蚀刻蚀蚀刻刻后后，，向向断断面面喷喷涂涂一一层层铂铂和和碳碳，，加加强强反反差差和和强强度度再再用用次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液消消化化样样品品，，剥剥下下碳碳和和铂铂的的膜膜，，即即复复膜膜复复膜膜代代表表标标本本蚀蚀刻刻面面的的形形态态，，电电镜镜下下的的影影像像即即代表标本断面的结构代表标本断面的结构（二）扫描电镜（二）扫描电镜（（Scanning electron microscope Scanning electron microscope (SEM)(SEM) * *问世于问世于2020世纪世纪6060年代；年代；* *用来观察标本的表面结构用来观察标本的表面结构 *扫描电镜的分辨力为扫描电镜的分辨力为6~10nm6~10nm，最大有效，最大有效放大倍率为放大倍率为20000X20000X。

工作原理工作原理* *用细的电子束扫描样品，在样品表面激用细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关表面结构有关 *次级电子由探测器收集，转为光信号，次级电子由探测器收集，转为光信号，再经光电倍增管和放大器转为电信号来控再经光电倍增管和放大器转为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像图像为立体，显示标本表面结构图像为立体，显示标本表面结构  为了使标本表面发射出次级电为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号束的轰击下发出次级电子信号 培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling (scanning tunneling microscope,STM)microscope,STM) Binnig Binnig等等19811981年发明，根据量年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。

子力学原理中的隧道效应而设计 BinnigBinnig等因此获得等因此获得19861986年诺贝年诺贝尔物理学奖尔物理学奖（一）工作原理（一）工作原理 当原子尺度的针尖在不到一纳米的高度扫描当原子尺度的针尖在不到一纳米的高度扫描样品时，此处电子云重叠，外加样品时，此处电子云重叠，外加2mV~2V2mV~2V电压，针电压，针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流隧道电流电流强度和针尖与样品间的距离有函电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系数关系 样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断改变，致电流改变将改变的电流间的距离不断改变，致电流改变将改变的电流图像化即可显示出原子水平的形态图像化即可显示出原子水平的形态 （二）主要特点（二）主要特点1 1、分辨率高，横向为、分辨率高，横向为0.1~0.2nm0.1~0.2nm，纵，纵向可达向可达0.001nm0.001nm；；2 2、可在固态、液态和气态下进行观察；、可在固态、液态和气态下进行观察；3 3、非破坏性观察。

非破坏性观察四、原子力显微镜四、原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)(atomic force microscope, AFM)* * BinningBinning在在STMSTM基础上发明基础上发明 * 特点：不要求样品是导电体特点：不要求样品是导电体 * 原理：针尖安装在灵敏的悬臂上，当原理：针尖安装在灵敏的悬臂上，当针尖原子与样品表面原子间的原子力变针尖原子与样品表面原子间的原子力变化时，悬臂发生偏移，通过激光可测出，化时，悬臂发生偏移，通过激光可测出，并扫描出原子水平的结构图像并扫描出原子水平的结构图像第二节第二节 细胞分离技术细胞分离技术一、离心技术一、离心技术离心是研究各种细胞器和大分子基本手离心是研究各种细胞器和大分子基本手段高速离心机高速离心机：转速为：转速为10~25Kr/min10~25Kr/min；；超速离心机超速离心机：转速超过：转速超过25Kr/min25Kr/min，离心，离心力大于力大于89K89Kｇ( (一一) )差速离心差速离心(differential centrifugation)(differential centrifugation) * *在密度均一的介质中由低速到高速逐级在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，分离不同大小的细胞和细胞器。

离心，分离不同大小的细胞和细胞器 *差速离心中细胞器沉降的顺序：核、线差速离心中细胞器沉降的顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核糖体与高基体、核糖体 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀( (二二) )密度梯度离心密度梯度离心(density gradient (density gradient centrifugation)centrifugation) 1 1、速度沉降、速度沉降: :用于分离密度相近而用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器大小不等的细胞或细胞器2 2、等密度沉降、等密度沉降: :适用于分离密度不适用于分离密度不等的颗粒等的颗粒 二、细胞电泳二、细胞电泳(cell (cell electrophoresis)electrophoresis)* *一定一定pHpH下，细胞表面带正或负电，可在下，细胞表面带正或负电，可在外加电场下发生泳动外加电场下发生泳动 *各种细胞带电量不同各种细胞带电量不同(ξ(ξ电位电位) )，在一定，在一定电场中的泳动速度不同通过测定电泳电场中的泳动速度不同。

通过测定电泳速度可推算出细胞的速度可推算出细胞的ξξ电位 *ξξ电位常因细胞生理和病理状态而异，电位常因细胞生理和病理状态而异，在诊断疾病上有一定价值在诊断疾病上有一定价值第三节第三节 细胞组分分析方法细胞组分分析方法 揭示细胞内生物大分子物质揭示细胞内生物大分子物质的功能及其相互间的关系的功能及其相互间的关系一、细胞化学技术一、细胞化学技术 利利用用染染色色剂剂可可同同细细胞胞的的某某种种成成分分发发生生反反应应而而着着色色的的原原理理，，对对某某种种成成分分进进行行定性或定位研究定性或定位研究 能能显显示示蛋蛋白白质质、、核核酸酸、、酶酶、、糖糖类类、、脂类、无机物等脂类、无机物等1 1、、SchiffSchiff反应反应( (FeulgenFeulgen反应反应) ) 细胞中的醛基可使细胞中的醛基可使SchiffSchiff试剂试剂中的无色品红变为红色常用于显中的无色品红变为红色常用于显示糖和脱氧核糖核酸（示糖和脱氧核糖核酸（FeulgenFeulgen反应）反应） 2 2、金属沉淀法、金属沉淀法 利用金属化合物在反应过程中生成有利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。

如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应性如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成产物最终生成CoSCoS或或PbSPbS有色沉淀，而显有色沉淀，而显示出酶活性示出酶活性 Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi apparatus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipitate upon reaction with the enzyme3 3、脂染色法、脂染色法：借苏丹染料溶于脂类：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色而使脂类显色 4 4、茚三酮反应、茚三酮反应：显示蛋白质显示蛋白质 5 5、联苯胺反应、联苯胺反应：过氧化物酶分解：过氧化物酶分解H H2 20 02 2产生新生氧，后者再将无色的联苯胺产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，变成棕色化合物。

氧化成联苯胺蓝，变成棕色化合物 二、免疫细胞化学二、免疫细胞化学 （（immunocytochemistryimmunocytochemistry）） * *根据免疫学原理，利用根据免疫学原理，利用抗体同抗原特异抗体同抗原特异性结合性结合，对抗原进行定位对抗原进行定位 *将抗体结合上标记物，再与组织中的抗将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原反应，可在光镜或电镜下显示出该抗原反应，可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于细胞或组织中的部位原存在于细胞或组织中的部位 1 1、免疫荧光法、免疫荧光法(immunofluorescent technique)(immunofluorescent technique) 采用荧光素（异硫氰酸酯、罗丹明）标记采用荧光素（异硫氰酸酯、罗丹明）标记将荧光色素同抗原或抗体结合，然后使其与组织将荧光色素同抗原或抗体结合，然后使其与组织切片或细胞涂片标本中各个相对应的抗体或抗原切片或细胞涂片标本中各个相对应的抗体或抗原结合，用荧光显微镜检查其定位的方法结合，用荧光显微镜检查其定位的方法 免疫荧光法有直接法和间接法（免疫荧光法有直接法和间接法（sa-ndwichsa-ndwich法）法）。

直接法直接法依靠荧光抗体与抗原或荧光抗原同抗体依靠荧光抗体与抗原或荧光抗原同抗体的结合；与此相反，的结合；与此相反，间接法间接法首先使抗原（抗体）首先使抗原（抗体）结合相对应的抗体（抗原），然后让那种抗体结合相对应的抗体（抗原），然后让那种抗体（抗原）与相对应的荧光抗原（抗体）结合抗原）与相对应的荧光抗原（抗体）结合 •2 2、酶标免疫法、酶标免疫法(enzyme-labeled antibody (enzyme-labeled antibody method)method) 采用酶（辣根过氧化物酶）标记，酶与采用酶（辣根过氧化物酶）标记，酶与底物反应后形成不透明的沉积物，显示出抗底物反应后形成不透明的沉积物，显示出抗原存在的部位原存在的部位•3 3、免疫电镜技术、免疫电镜技术：用重金属标记，如胶体金：用重金属标记，如胶体金免疫电镜照片免疫电镜照片：抗体：抗体用胶体金颗粒标记用胶体金颗粒标记. . 显示胰岛素分泌细胞显示胰岛素分泌细胞中胰岛素的存在部位中胰岛素的存在部位和方式三、放射自显影术三、放射自显影术(radioautography)(radioautography)* *用于研究被标记化合物在组织和细胞中的分布用于研究被标记化合物在组织和细胞中的分布及动态。

及动态 *原理：将放射性同位素原理：将放射性同位素( (1414C C和和3 3H)H)标记的化合物标记的化合物导入生物体内，将标本制成切片，涂上卤化银乳导入生物体内，将标本制成切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光经显影显示黑胶，经放射性曝光，使乳胶感光经显影显示黑色银颗粒，即可知标本中标记物的位置和数量色银颗粒，即可知标本中标记物的位置和数量 *这种技术与电镜结合，则为这种技术与电镜结合，则为电镜放射自显影术电镜放射自显影术电镜放射自显影照片电镜放射自显影照片：： 胰腺细胞饲喂含 3H的亮氨酸 5分钟，这种氨基酸大部分都被合成胰岛素黑色银颗粒显示，胰岛素最初出现在内质网，10分钟后被运到高尔基体 (A), 45分钟后它出现在分泌小泡中 (B).四、分子杂交技术四、分子杂交技术(molecular hybridization)(molecular hybridization)* * 是在是在DNADNA分子变性和复性基础上发展起分子变性和复性基础上发展起来的一种技术来的一种技术 * 原理：具互补核苷酸序列的两条单链原理：具互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子，适宜条件下，可结合形成核苷酸分子，适宜条件下，可结合形成DNA-DNADNA-DNA，，DNA-RNADNA-RNA或或 RNA-RNARNA-RNA杂交的双杂交的双链分子。

链分子 * 可测定单链核苷酸间序列有否互补可测定单链核苷酸间序列有否互补( (一一) )原位杂交原位杂交( (in situin situ hybridization) hybridization)用来检测染色体上的特殊用来检测染色体上的特殊DNADNA序列1 1、带放射性、带放射性DNADNA探针；探针；2 2、免疫探针法、免疫探针法（二）（二）SouthernSouthern杂交杂交* *是是体外体外分析特异分析特异DNADNA序列的方法序列的方法 * 先用限制性内切酶将先用限制性内切酶将DNADNA切成片段，经切成片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用标记的探针杂交，辨认出与探上，再用标记的探针杂交，辨认出与探针互补的特殊核苷序列针互补的特殊核苷序列 五、定量细胞化学技术五、定量细胞化学技术（一）显微分光光度测定技术（一）显微分光光度测定技术 细胞中有些成分具特定的吸收光谱，细胞中有些成分具特定的吸收光谱，如核酸的吸收波长为如核酸的吸收波长为260nm260nm，蛋白质为，蛋白质为280nm280nm 根据细胞成分的这种特性，可用显根据细胞成分的这种特性，可用显微分光光度计对某些成分进行定量测定。

微分光光度计对某些成分进行定量测定 （二）流式细胞术（二）流式细胞术（（flow cytometeryflow cytometery））* *对单个细胞进行分选与定量分析对单个细胞进行分选与定量分析 *原理：对待测成分染色或抗体标记，用鞘原理：对待测成分染色或抗体标记，用鞘液的液滴包裹单个细胞，在激光束照射下，液的液滴包裹单个细胞，在激光束照射下，细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，依据电信号进行分选转换为电信号，依据电信号进行分选 *所用仪器为流式细胞仪分离纯度达所用仪器为流式细胞仪分离纯度达99%99% 第四节第四节 细胞培养、细胞工程细胞培养、细胞工程与显微操作技术与显微操作技术 一、细胞培养（一、细胞培养（cell cell cultureculture）） * *高等生物由多细胞构成，整体条件下要高等生物由多细胞构成，整体条件下要研究单个细胞或某群细胞在体内的活动、研究单个细胞或某群细胞在体内的活动、功能很困难把活细胞进行体外培养观功能很困难把活细胞进行体外培养观察研究，方便得多察研究，方便得多 *细胞培养就是选用最佳生存条件对活细细胞培养就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养的技术。

胞进行培养的技术 （一）动物细胞培养（一）动物细胞培养 1 1、群体培养、群体培养(mass culture)(mass culture): :将含一定数将含一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；生长，汇合后形成均匀的单细胞层；2 2、克隆培养、克隆培养(clonal culture)(clonal culture)，将高度，将高度稀释的细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞稀释的细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，经生长增殖每个细胞形成一个细贴壁后，经生长增殖每个细胞形成一个细胞群落，称为克隆（胞群落，称为克隆（cloneclone） 群体培养（左）和克隆培养（右）群体培养（左）和克隆培养（右） 原代培养原代培养 （（primary cultureprimary culture））：从动：从动物机体取出的进行培养的细胞群原代物机体取出的进行培养的细胞群原代培养的细胞生长较缓慢，且繁殖一定代培养的细胞生长较缓慢，且繁殖一定代数后数后( (一般一般1010代代) )停止生长，需更换培养停止生长，需更换培养基。

基传代培养（传代培养（PassagePassage）：）：将细胞从一个将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶培养瓶转移到另外一个培养瓶 （二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 1 1、组织培养、组织培养：诱发愈伤组织，培养再生：诱发愈伤组织，培养再生植株2 2、细胞悬浮培养、细胞悬浮培养：愈伤组织培养基础上：愈伤组织培养基础上发展起来制取植物代谢产物发展起来制取植物代谢产物 3 3、原生质体培养、原生质体培养：诱导分化成植株；易：诱导分化成植株；易进行遗传转化；进行细胞融合；进行遗传转化；进行细胞融合； 4 4、单倍体培养、单倍体培养：花药或花粉培养获得单：花药或花粉培养获得单倍体植株，人工加倍后可得纯合个体倍体植株，人工加倍后可得纯合个体 二、细胞工程二、细胞工程(cell (cell engineering)engineering) 按照人类的需要或愿望，采用工程按照人类的需要或愿望，采用工程学手段，对细胞进行遗传改造的技术学手段，对细胞进行遗传改造的技术（一）细胞融合（一）细胞融合 （（cell cell fusionfusion）） * *通过培养和诱导，两个或多个细胞合并通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程成一个双核或多核细胞的过程 。

*同种细胞在培养时靠在一起的同种细胞在培养时靠在一起的2 2个细胞个细胞自发合并，称自发融合；异种细胞间须自发合并，称自发融合；异种细胞间须经诱导才能融合，称诱发融合经诱导才能融合，称诱发融合 诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法 1 1、生物方法、生物方法：仙台病毒、副流感病毒的：仙台病毒、副流感病毒的包衣含融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞包衣含融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞融合融合，也可介导细胞与细胞融合2 2、化学方法、化学方法：聚乙二醇：聚乙二醇PEGPEG；；3 3、物理方法、物理方法：电激和激光电激和激光 化学和物理方法可造成膜脂分子排列化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，诱导相接触的细胞发生融合的改变，诱导相接触的细胞发生融合 （二）单克隆抗体技术（二）单克隆抗体技术(monoclonal antibody)(monoclonal antibody)* *英国科学家英国科学家KohlerKohler和和Milstein 1975Milstein 1975年年创立该项技术，获创立该项技术，获19841984年诺贝尔生理学年诺贝尔生理学奖。

奖 * *正常淋巴细胞具分泌抗体的能力，但不正常淋巴细胞具分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可在体外长能在体外长期培养，瘤细胞可在体外长期培养，但不分泌抗体两者融合后，期培养，但不分泌抗体两者融合后，既可无限繁殖，又可产生抗体既可无限繁殖，又可产生抗体（三）显微操作技术（三）显微操作技术（（micromanipulationmicromanipulation）） 是指在高倍复式显微镜下，利用显是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（微操作器（micromanipulatormicromanipulator）进行细）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法胞或早期胚胎操作的一种方法 显微操作技术包括细胞核移植、显显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等微切割等 第五节第五节 遗传遗传/ /基因工程基因工程 将不同来源的基因，按照人们的设计，将不同来源的基因，按照人们的设计，在体外构建成杂种在体外构建成杂种DNADNA分子，然后导入活分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种。

新品种一、一、PCRPCR技术技术（（polymerase chain polymerase chain reactionreaction））即即聚合酶链式反应聚合酶链式反应技术，用于在体外将微量技术，用于在体外将微量的目标的目标DNADNA大量扩增大量扩增反应过程反应过程：：1 1、变性、变性：：90℃90℃下使下使DNADNA双链解离；双链解离；2 2、复性、复性：：60℃60℃下退火，使引物与模板结合；下退火，使引物与模板结合；3 3、延伸、延伸：：升温至升温至70℃70℃，在引物的引导下合成，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成模板单链的互补链，从而形成DNADNA双链片段双链片段经经2020次循环，扩增大量目标次循环，扩增大量目标DNADNA 二、二、DNADNA克隆技术克隆技术三、植物基因工程三、植物基因工程主要步骤：主要步骤：植物组织培养植物组织培养→→愈伤组织愈伤组织→→用带目标基用带目标基因的细菌感染因的细菌感染→→分化产生新植株分化产生新植株→→筛选筛选出带目标基因的植株出带目标基因的植株四、选择性基因剔除四、选择性基因剔除(gene knockout)(gene knockout)基因剔除鼠：基因剔除鼠：用突变基因用突变基因(CFTR(CFTR- - ) )构建质粒构建质粒→→感染来自感染来自胚囊的干细胞胚囊的干细胞→→筛选出感染成功的干细胞筛选出感染成功的干细胞→→置入胚囊置入胚囊→→发育成嵌合体鼠发育成嵌合体鼠→→用带用带CFTRCFTR- - 的精子与野生鼠的精子与野生鼠(CFTR (CFTR + + ) )交配交配→→产生杂合产生杂合体体→→经杂合体间交配产生纯合体经杂合体间交配产生纯合体THANKS!。