新型巯基化合物近红外BODIPY类荧光试剂的合成与应用研究.docx

新型航基化合物近红外BODIP偿荧光试剂的合成与应用研究谷胱甘肽（GSH剂半胱氨酸（Cys）等小分子琉基化合物（RSH）广泛分布于生物体中，在新陈代谢活动中起着关键作用作为主要的还原物质，RSH可清除活性氧和自由基，维持机体的氧化还原平衡；RSH®可与一氧化氮（NO）反应生成S-亚硝基硫醇（RSNO）,作为NO的“储存池”，从而间接参与信号转导当RSH^量出现异常时，会导致肝损伤、阿尔茨海默病、癌症、艾滋病等疾病鉴于巯基化合物在生物体内独特的生理病理功能,检测其在生物体内的含量、含量变化及其动态分布意义重大荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、直观、可视化等优势,在化学、生命科学、医学和环境科学等领域应用广泛近红外（NIRF,>600nm）荧光由于背景干扰少、组织穿透力强、对生物损伤小等优点逐渐成为人们关注的焦点,而性能优异的有机小分子荧光试剂在近红外荧光中的应用最多然而,理想的有机小分子荧光试剂仍然较少二氟化硼-二吡咯甲烷（Borondipyrromethene,BODIPY求光团的摩尔吸光系数大、荧光量子产率高，荧光不受溶剂、pH值及光照影响因此,本论文通过在其3-、5-位引入苯乙烯基扩大共轭体系的方式,设计合成了新型的近红外荧光试剂1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2’-马来酰亚胺基）-二氟化硼-二叱咯甲烷（DMDSPAB-o-M）：1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（4'-碘乙酰胺基）-二氟化硼-二叱咯甲烷（DMDSPAB-I）结合荧光光度计、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、荧光显微镜等分析手段，利用新合成的近红外荧光试剂,建立了多种测定血液、细胞、组织等动植物样品中巯基化合物及含量变化的新方法，包括可视化同时监测RS书口NO的荧光成像法。

具体研究工作包括以下几个方面：（1）用苯乙烯基扩大BODIPY勺共腕体系,并以其为母体荧光团、以马来酰亚胺基或碘乙酰胺基为巯基化合物的识别基团,设计合成了新型的近红外荧光生成试剂DMDSPAB-o-M近红外荧光标记试剂DMDSPAB-济对其进行结构表征,详细考察了试剂及其琉基衍生产物的荧光分析性能DMDSPAB-o-M光量子产率仅为0.005,与琉基化合物快速反应后,荧光增强43倍（①=0.215）DMDSPAB-o-M衍生产物的激发/发射波长均为632/645nm；两者的荧光经激光照射120min或在pH2.0-11.0范围内，强度基本不变DMDSPAB本身具有强荧光（①=0.557）,其衍生产物的荧光量子产率也高达0.560DMDSPAB-R衍生产物的激发/发射波长均为620/630nm,具有与DMDSPAB-o-M衍生产物相同的光稳定性，且pH适用范围更宽2）基于"turn-on"型近红外荧光试剂DMDSPAB-o-Mg立了直接测定GSH勺荧光光度法在pH9.0PBS缓冲溶液中,37℃衍生5min方法的线性范围为6-200nM,检出限（S/N=3）为0.44nM半胱氨酸（Cys）与GSH勺摩尔比小于1/2时不干扰，可直接测定多数样品中的GSH小鼠全血和肝脏分析的加标回收率在95.2%-102.6%之间。

该方法无需分离，灵敏度高，选择性好，简便快速3）DMDSPAB-o-M为"turn-on"型荧光试剂,脂溶性好,易透膜,易穿透组织,因此将其用于人脐静脉内皮细胞（ECV-304）和小鼠肝脏组织中巯基化合物的荧光成像在优化的条件下，DMDSPAB-o-Mf细胞孵育5min即可生成明亮的红色荧光；将其注入小鼠体内30min,肝脏组织即可观察到较强荧光对肝损伤小鼠肝脏组织成像发现荧光明显减弱,表明其中巯基化物含量降低该荧光成像法生物毒性低、无背景荧光干扰,荧光强度与巯基化合物水平呈正相关,可快速灵敏地反映细胞或组织中巯基化合物的含量变化及空间分布,在与巯基化合物含量变化相关的生理、病理可视化研究及生物医学诊治中具有重要的应用价值4）RSH和NO是生物体内关系密切、相互作用复杂的两类生物活性分子,利用双标记法实现了细胞及组织样品中这两类分子的同时双色荧光成像以DMDSPAB-o-M记RSH1,3,5,7-四甲基-8-（3',4'-二氨基苯基）-二氟化硼-二毗咯甲烷（DAMB%记NO两试剂与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Raw264.7）、人宫颈癌细胞（HeLa）或洋葱组织共同孵育，以590、475nm波长分别激发，同时双色荧光成像。

结果表明，与RSHlENO的单标记成像相比，该方法能同时反映同一样本中RSH、NO的实时分布及彼此之间的含量变化关系,更符合实际状况,为更准确、深入研究RSH、NO的生理功能及相互作用提供了直观有效的新技术平台5）DMDSPAB-I及其琉基衍生产物具有强荧光且受溶剂和pH的影响较小，非常适合柱前衍生、高效液相色谱分析以GSH,Cys、高半月氨酸（Hcy）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、半胱氨酰甘氨酸（CysGly）及青霉胺（PA）六种小分子琉基化合物为对象进行研究，发现最佳衍生条件为pH11.0Na2B4O7-NaOHg冲溶液、45℃、25min在C18柱上，以甲醇/四氢味喃/水/pH2.0H3Cit-NaOH缓冲溶液（77:6:12:5,v/v/v/v）为流动相,25min基线分离S/N=3时，最低检出限为0.24nM将建立的方法用于小鼠血样中巯基化合物的测定,加标回收率在94.7%-104.3%之间，相对标准偏差（RSDs）小于4.8%与已有柱前衍生HPLC&相比,近红外荧光衍生试剂的应用使色谱基线更平滑、样品干扰峰更少、检出限更低6)DMDSPAB-及其琉基衍生产物的激发波长为620/630nm,与635nm半导体激光器的激发波长相匹配。

以DMDSPAB-为衍生试剂，建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光(CE-LIF)检测GSHCys、Hcy、丫-谷氨酰半胱氨酸(y-GluCys)、CysGly和NA6种小分子琉基化合物的分析方法在含有16mMpH7.0柠檬酸钠缓冲溶液和60%(v/v)乙腈的背景电解质中,14min可实现分离,检出限(S/N=3)可达0.11-0.31nM将建立的LIF-CE新方法用于黄瓜、西红柿及拟南芥植物样品中痕量巯基化合物的测定,加标回收率为96.5%-104.3%,RSDs小于4.4%作为首次应用于RSH&离检测的NIRLIF-CE,该方法具有分离快、干扰少、检出限低等优点。