犬瘟热病毒在MA-104Marc-145Vero三种细胞内.docx

王朝蕾 1 崔卓宇 吕永钢 胡江锋 焦铁军 樊军喜 王根红 崔瑞宁（杨凌绿方生物工程有限公司，陕西杨凌 712100）摘要：本试验比较了 MA-104、Marc-145 、Vero 三种猴肾细胞增殖犬瘟热病毒的敏感性，按常规方法将犬瘟热病毒（CDV-XN112 株）分别接种于 MA-104、Marc-145、Vero 三种细胞，通过观察细胞病变，确定收毒时间，比较病毒滴度结果表明犬瘟热病毒可在 MA-104、Marc-145、Vero 三种细胞内增殖，出现典型细胞病变，效价均达到 105.5TCID50/mL以上，而 Vero 细胞增殖犬瘟热病毒更为经济高效，是增殖该病毒的理想细胞关键词：犬瘟热病毒 细胞培养 病毒含量Multiplication Effect Comparison of Canine Distemper Virus in MA-104, Marc-145, and Vero cellsWANG Zhao-lei, CUI Zhuo-yu, LV Yong-gang, HU Jiang-feng, JIAO Tie-jun, FAN Jun-xi, WANG Gen-hong, CUI Rui-ning（Yangling Lvfang Bio-engineering Co. LTD, yangling, Shaanxi 712100, China）Abstract: Canine distemper virus (CDV-XN112 strain) was Inoculated into MA-104, Marc-145 and Vero cells, the sensitivity of three types of monkey kidney to CDV were compared by observation cell pathological effect after cultivation, determination time for harvesting virus, comparison of virus titers. The results showed that three cells be suitable for CDV, th titers of virus harvest fluids more than 105.5TCID50/mL, but Vero cell is amore cost-effective and ideal cell of proliferation CDV.Keywords: Canine distemper virus; cell culture; virus titer犬瘟热是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病。

以早期表现双相热、急性卡他性鼻炎以及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征，少数病犬的鼻和足垫可发生角质化过度1905 年 Carre 发现其病原为病毒，1980 年我国分离获得本病毒，此病广泛分布于全世界 [1]犬瘟热病是对犬危害最严重的传染病之一，近年来在全国各地普遍流行，给养犬业造成巨大损失目前，本病尚无有效的治疗措施，主要通过疫苗接种来控制其传播犬瘟热病毒能在鸡胚成纤维原代细胞内增殖，也能适应于许多灵长类动物原代和传代细胞，并可产生可见的细胞病变，有时形成持续性感染 [2]为了更加有利于工业化规模生产，本试验通过MA-104、Marc-145、Vero 三种猴肾细胞在相同条件下分别增殖犬瘟热病毒 [3]，筛选出适应于犬瘟热病毒（CDV-XN112 株）增殖理想的细胞1 材料与方法1.1 细胞 MA-104、Marc-145 、Vero 三种细胞，由公司研发中心提供1.2 病毒 犬瘟热病毒（CDV-XN112 株）由公司质量管理部提供1.3 主要试剂 MEM 培养基（Gibco 产品），胰蛋白酶（Amresco 产品）按说明配制后经 0.22um 微孔滤膜过滤除菌备用。

1.4 新生牛血清 购自内蒙金源康生物工程有限公司1.5 主要仪器设备 二氧化碳培养箱、细胞培养瓶（10000ml ）、细胞观察台、转瓶机、百级洁净层流罩1王朝蕾（1980—） ，女，助理兽医师，主要从事兽用生物制品的检验工作1.6 溶液配制 用滤过除菌的 MEM 作为培养液，生长液中含 8%新生牛血清，调整pH 为 7.0~7.2，维持液中含 3%新生牛血清，调 pH7.2~7.41.7 病毒增殖 用 MA-104、Marc-145 、Vero 三种细胞分别增殖犬瘟热病毒，连续增殖 5 代1.7.1 将生长成良好单层的 MA-104 细胞传代，分散比例为 1：3 或 1：4置于 37℃温室中培养，每 3 天传代一次48h 后将长成良好单层 MA-104 细胞，弃去培养液，按细胞悬液的 5%接种病毒，37℃吸附 1h 后加入维持液，置于 35℃温室中培养，接毒后每 6h 观察细胞，CPE 达 75%以上时收获，反复冻融 2 次后混合，无菌取样待检1.7.2 将生长成良好单层的 Marc-145 细胞传代，分散比例为 1:3 或 1：4置于 37.0℃温室中培养，每 3 天传代一次。

48h 后将长成良好单层 Marc-145 细胞，弃去培养液，按细胞悬液的 5%接种病毒，37℃ 吸附 1h 后加入维持液，置于 35℃温室中培养，接毒后每 6h观察细胞，CPE 达 75%以上时收获，反复冻融 2 次后混合，无菌取样待检1.7.3 将生长成良好单层的 Vero 细胞传代，分散比例为 1:3 或 1：4置于 37℃温室中培养，每三天传代一次48h 后将长成良好单层 Vero 细胞，弃去培养液，按细胞悬液的 5%接种病毒，37℃吸附 1h 后加入维持液，置于 35℃温室中培养，接毒后每 6h 观察细胞，CPE达 75%以上时收获，反复冻融 2 次后混合，无菌取样待检1.8. 病毒含量测定将待检样品分别作 10 倍系列稀释，取其中 10-3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7 五个稀释度，分别接种于长满良好单层的 MA-104、Marc-145 、Vero 细胞 96 孔细胞培养板中，每个稀释度接种 6 孔，0.1mL/孔，另设 6 孔只接种稀释液作为空白对照，0.1mL/ 孔吸附 1h 后各孔加维持液，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 120h，每天观察各孔细胞病变情况，出现病变即为感染，并及时记录结果，按 Reed-Muench 法[4]计算 TCID50。

2 结果2.1 各组细胞接毒后的 CPE 情况 各实验组细胞接毒后，每 6h 观察病变一次，观察结果如表 1 所示表 1. 不同细胞接种犬瘟热病毒引起细胞病变观察结果 观察细胞不同时间（h）病变结果组别66 72 78 84 90 96 102 108 114 120 125 131 135MA-104 - - + + + + ++ ++ ++ +++ +++ / /Marc-145 - - - - + + + + ++ ++ ++ +++ +++Vero - - + + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ / /注：表中（+）表示 25%以内细胞出现 CPE；（++）25%~50%细胞出现 CPE；（+++ ）50%~75%细胞出现 CPE；（-）无 CPE；（/）表示已收毒从表 1 中我们看出，MA-104、Vero 细胞接种犬瘟热病毒后，在 78h 开始产生病变，Marc-145 在 90h 才开始产生病变；细胞收毒 MA-104、Vero 比 Marc-145 提前了 10h2.2 病毒含量测定结果 各待检样品 TCID50 测定情况见表 2表 2. 各组 TCID50 测定结果名称/代次 TCID50/0.1mL 名称/代次 TCID50/0.1mL 名称/代次 TCID50/0.1mLMA-104F1 10-5.5 Marc-145F1 10-4.75 VeroF1 10-5.64MA-104F2 10-5.5 Marc-145F2 10-5.0 VeroF2 10-5.75MA-104F3 10-5.64 Marc-145F3 10-5.25 VeroF3 10-6.0MA-104F4 10-5.64 Marc-145F4 10-5.5 VeroF4 10-6.25MA-104F5 10-5.71 Marc-145F5 10-5.5 VeroF5 10-6.5从表 2 中我们可以看出，MA-104、Marc-145 、Vero 三种细胞增殖犬瘟热病毒毒价均能达到《犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒和细小病毒病五联活疫苗制造及检验规程》中犬瘟热病毒半成品检验的要求（10 4.5TCID50/0.1mL） [5]。

因此 MA-104、Marc-145、Vero三种细胞是增殖犬瘟热病毒（CDV-XN112 株）理想的细胞3 讨论利用 Vero、MA104 细胞增殖犬瘟热病毒是目前国内外生产犬瘟热弱毒疫苗的主要方法据报道，Marc-145 细胞来源于猴肾细胞，从母细胞 MA-104 克隆而得到，可连续传代培养 [6]生产中，在保证质量的前提下，效率和成本是各生产厂家考虑的首要问题，细胞接种犬瘟热病毒后在 35℃温室培养，开始产生 CPE 时间在 78h 以后，细胞收毒在 125h 左右，病毒含量测定结果表明犬瘟热病毒虽然在 MA-104、 Marc-145、Vero 三种猴肾细胞内增殖毒价均能达到 104.5TCID50/0.1ml 的要求，但是 Vero 细胞增殖该病毒更为经济高效，魏凤等 [7]的报道也提到此观点关于 Vero 细胞增殖的 CDV 毒液制成疫苗后的动物免疫试验，有待进一步研究参考文献：[1]蔡宝祥.家畜传染病学（第四版）［M］.北京:中国农业出版社,2001.347-351.[2]殷震，刘景华. 动物病毒学（第二版）［M］.北京：科学出版社， 2001：756-762.[3]李六金，金昌德等.犬瘟热病毒流行株的驯化与鉴定[J].第四军医大学学报，2000，06.[4]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品质量标准 (2001 年版)［M］.北京:中国农业科技出版社，2001：303.[5]中华人民共和国农业部第 1049 号公告.[6]兰海楠，张辉，崔焕忠等. Marc-145 细胞培养条件探索及其初步应用 [J]《中国畜牧兽医》2011，38（5）：59-60.[7]魏凤 管宇 王金良 沈志强等.犬瘟热病毒在不同组织细胞上增殖特性的研究 [J]《动物医学进展》2010，02：83-86.。