2022年等温滴定量热法在生命科学研究中应用.docx

等温滴定量热法在生命科学研究中应用0等温滴定量热法 (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) 是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法， 它通过高灵敏度、 高自动化的微量量热仪连续、 准确的监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、和无损伤的同时提供热力学和动力学信息微量热法具有许多独特之处 它对被研究体系的溶剂性质、 光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高 (本仪器最小可检测热功率 2 nW ，最小可检测热效应 0.125uJ ，生物样品最小用量 0.4ug ，温度范围 2 0C - 80 0C ，滴定池体积 1.43 ml)实验时间较短 (典型的 ITC 实验只需 30-60 分钟，并加上几分钟的响应时间 )，操作简单 (整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由 Origin 软件分析 ITC 得到的数据 )测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。

尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性， 因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果， 这有助于发现新现象和新规律， 特别适应于研究生物体系中的各种特异过程ITC 的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、)摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数ITC 的应用范围蛋白质 -蛋白质相互作用 (包括抗原 -抗体相互作用和分子伴侣 -底物相互作用 )蛋白质折叠 /去折叠蛋白质 -小分子相互作用以及酶 -抑制剂相互作用酶促反应动力学药物 -DNA/RNA 相互作用 RNA 折叠蛋白质 -核酸相互作用核酸 -小分子相互作用核酸 -核酸相互作用生物分子 -细胞相互作用 ⋯ ⋯加样体积：（实际体积）cell ：1.43 ml，syringe ：300 μ l准备样品体积（最少量）cell ：2 ml ，syringe ： 500 μ l样品浓度 cell ：几十 μ M到几 mM syringe ：几百 μ M到几十 mM 测量 Kb 范围 102-1012 M-1 滴定实验前恒温 30-60 min 等温滴定量热实验所需时间，一般 1.5-4 hr 微量热技术 (Microcalorimetry) (2008-05-27 19:58:14)标签： 杂谈微量热法 (包括等温滴定量热和差示扫描量热 )是近年来发展起来的 研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法， 它通过高灵敏度、 高自动化的微量量热仪连续和准确的监测和记录一 变化过程的量热曲线， 原位 (in situ) 、 (on-line) 和无损伤的同时提供热力学和动力学信息。

微量热法具有以下特点：1.它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件2.样品用量小 ,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液3.量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析4.微量热法缺乏特异性但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律微量热法在生物大分子研究中的应用主要有：1.酶促反应2. 蛋白质去折叠 /折叠3.抗原 -抗体相互作用4.分子伴侣 -底物相互作用5.药物 -核酸相互作用等温滴定量热法（ Isothermal Titration Calorimetry ，ITC ）实验是通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中 每次滴定后， 反应热放出或吸收，这些都可以被 ITC 所检测到检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数1 ITC 的特点ITC 能测量到的热效应最低可达 125 nJ，最小可检测热功率 2 nW，生物样品最小用量 0.4 μg，而且这些年来 ITC 的灵敏度得到了提高，降低了响应时间（小于 10 s）。

ITC 不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数（Ka ）、结合位点数 （n），结合焓 （△ H）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的K m 和 k cat）AUC 实验需要ITC 也比那些选择分析方式（如分析型超速离心法，AUC ）快，一个单纯的几个小时甚至几天去完成，而典型的ITC 实验只需 30~60 分钟，在加上几分钟的响应时间整个实验有计算机控制，使用者只需输入实验的参数（温度、注射次数、注射量等）计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC 得到的数据其精确度高以及操作简单 ITC 获取的结果示意图 上图：峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量下图： 以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为横坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线2 ITC 的应用 1）蛋白质 -小分子和酶 -抑制物相互作用2）蛋白质 -糖类相互作用3）蛋白质 -蛋白质相互作用：如 Jacobson 等用 ITC 研究了人细胞 RNA 聚合酶Ⅱ转录因子 TFIID 的最大亚单位 TAFII250 的组蛋白乙酰基转移酶活性 (Jacobson et al., 2000)。

日本 Kanagawa 科学技术研究所的 Tahirov 等利用 ITC 、CD 和 UV 研究了 AML1/Runx-1 小结构 域识别的 DNA 结构及 CBFβ 控制的构象调整，阐明了 CBFβ 与 CBFα 间的相互作用模式 及前者调控后者结合到 DNA 上的机制 (Tahirov, et al., 2001)3）蛋白质 -脂质相互作用4）脂质间以及脂质 -小分子相互作用5）核酸 -小分子相互作用6）蛋白质 -核酸相互作用7）核酸 -核酸相互作用8）抗体研究： 美国 Johns Hopkins 大学生物系的生物量热学中心是 世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室，该中心的 Freire 小组 (Murphy et al., 1993, 1995) 应用高灵敏度 ITC 分别研究了血管紧缩素与其单 克隆 抗体和酸诱导去折叠细胞色素 c 与其单 克隆 抗体的结合， 发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应， 实验结果表明， 这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失9）受体相互作用10）蛋白质折叠和稳定性：如美国的Wright 小组应用 ITC 和核磁共振 (NMR) 等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素 A 受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱， 但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的， 并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋异二聚体。

11）酶分析：如 Freire 小组应用等温滴定微量热法 (ITC) 结合高灵敏度差示扫描量热法 (DSC)和分光光度法研究了酵母细胞色素 C 氧化酶催化氧化其生理底物—亚铁细胞色素 c 的热力学和动力学， 并分析了原盐效应对该酶活性的影响 我们应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息 ,探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化切割DNA 的反应，从热力学和动力学的角度严格的证明了博莱霉素在催化机制上类似于DNA 切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化 ATP 与肌酸间转磷酸化反应的热力学， 从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应， 还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法—微量热测活法值得指出的是， ITC 不仅被应用于研究蛋白质折叠 /去折叠，而且被应用于核酸折叠，例如英国的 Hammann 等人利用 ITC 研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学， 发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应， 和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。

ITC 应用示例1 ITC 法测量结合 /解离常数Christian Herrmann 等运用 ITC 研究了 Ras 与效应物和Cdc42 与效应物的相互作用Ras 是一种在 信号转导 过程中起重要作用的蛋白质 可以向其下游的许多 信号转导 途径输送细胞内调控信号 Ras 在非激活态，与 GDP 结合，当 GDP 被 GTP 取代时被激活，与其效应物（ Raf，RalGDS， 3-磷脂酰肌醇激酶）呈现 紧密的结合 Cdc42 是一种 GTPase，也是信号转导 相关的蛋白 它参与细胞增殖调控和肌动蛋白细胞骨架的调控 Cdc42 在参与细胞骨架调控的过程中，很重要的一步是与 WASP 蛋白的相互作用 Ras 及其效应物（ Raf，RalGDS）的结合方式都很类似， 包括富含亲水氨基酸侧链的反平行 ?－折叠 Cdc42 及其效应物 (WASP)的结合区则富含疏水氨基酸，其复合物也比Ras/效应物复合物大得多ITC 可以直接测量焓变△ H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信图 18-7 实验结果： 20℃时 GCN4-D 和 GCN4-M 与 AP-1 的滴定反应和拟合曲线(a) GCN4-D 滴定 AP-1。

b) GCN-M 滴定 AP-1 这里是以独立结合位点模型进行最小二乘法拟合计算出了结合常数Kb、结合焓变ΔH0 和结合计量数 N 等值（结果见表18-1、2）研究结果：ITC 测定的反应热既包含结合反应又包含折叠反应肽与DNA 结合过程伴随着肽的构象折叠和疏水表面包埋肽的构象中熵的损失对熵变的不利贡献大于溶剂效应产生的有利贡献，由于包埋疏水表面时所引起的结合水的损失对熵变产生有利贡献，中总的熵变对结合是不利的产生熵变的因素有：1）疏水作用产生的有利贡献因此肽与 DNA 结合过程2）肽与 DNA 形成复合物由于转动和平移自由度的减小引起的熵损失3）结合过程中肽与 DNA 的折叠或其他构象变化产生的不利贡献表 18-1GCN4-D 与 AP-1 和 CRE 结合的热力学参数-35.4 ±0.3-48.8 ±1.0181.04 ±0.052.25 ±0.25-84.2 ±0.7200.98 ±0.033.26 ±0.12-87.0 ±0.8-36.5 ±0.1-50.5 ±0.9AP-1。