医学检验 血常规五分类血液分析仪原理大观.doc

血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图二 仪器原理和散点图特点 1 体积、电导和激光散射原理 这是Beckman－Coulter公司生产的血细胞分析仪所采用的经典分析方法，他集三种物理学检测技术于一体，在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参数分析该方法也称为体积、电导、激光散射血细胞分析法此技术采用在标本中首先加入红细胞溶血剂溶解掉红细胞，然后加入稳定剂来中和红细胞溶解剂的作用，使白细胞表面、胞浆和细胞体积保持稳定不变然后应用鞘流技术将细胞推进到流动细胞计数池（Flowcell）中，接受仪器VCS三种技术的检测 V代表体积（Volume）测量法，是采用经典的库尔特专利技术，用低频电流准确分析细胞体积体积是区分白细胞亚群的一个重要的参数，它可有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细胞C代表高频电导性（Conductivity），采用高频电磁探针原理测量细胞内部结构间的差异，也是该公司的专利技术细胞膜对高频电流具有传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份可使电流的传导性产生变化，其变化量可以反映出细胞内含物的信息该参数可用来区分体积相近而内部性质不同的细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，由于它们的细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。

S代表激光散射（Scatter）测量技术，采用氦氖激光源发出的单色激光扫描每个细胞，收集细胞在10°～70°角度内出现的散射光 (MALS)信号该激光束可穿透细胞，探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，提供有关细胞颗粒性的信息，可以区分出颗粒特性不同的细胞群体例如细胞内颗粒粗的要比颗粒细的散射光更强，因此可以用于区分粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞 图1 VCS法的测定原理 仪器将分析每个细胞在V、C、S 三种检测技术上的测量结果，因为不同类别的细胞会在体积、表面特征、内部结构等方面呈现明显的不同将这些特征性信息被定义到以VCS为三维坐标(分辨率为256×256×256=16,777,216)所形成的立体散点图中，这五类细胞可在三维空间中形成特定的细胞群通过计算某群细胞数量占白细胞总数的百分比，即可得到五项白细胞分类结果仪器不仅仅做出对正常白细胞的五项分类结果，给出典型的散点图型，还可以提示许多异常细胞区域的报警 VCS技术可通过DF1、DF2、DF3三个散点图将五种类型白细胞明显区分开三个散点图的纵坐标均定义为细胞体积DF1为细胞体积和激光散射的直方图，DF2和DF3为细胞体积和高频电导性的直方图，DF3为除去粒细胞群体后显示出淋巴细胞后面的嗜碱性粒细胞图像。

图2 各类白细胞在VCS三维空间中的分布特点 图3 各类白细胞在散点图中的分布特点 VCS技术是Beckman－Coulter公司开发研制的经典专有方法，到目前为止的各种高档血细胞分析仪均采用该方法对白细胞进行分析该方法在白细胞分析上尚有特殊能力，例如可以测定和分析中性粒细胞的体积、核浆比例、细胞颗粒特性等参数，也就是将中性粒细胞的VCS三个参数分别给出，用于了解细菌感性疾病与其它疾病的区别也可对淋巴细胞、单核细胞等均作出其细胞群体的三个技术参数值，是比较有前景的研究内容 仪器在RBC、PLT、WBC计数上依然采用电阻抗法，血红蛋白仍然采用比色法测定该公司的五分类法血细胞分析仪先后推出多种类型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755和最新的LH780等型号，在某些机型还具有网织红细胞分析功能和T淋巴细胞亚群分析功能 2. 电阻抗、射频和细胞化学技术 日本Sysmex公司系列血细胞分析仪是在国内应用非常广泛的仪器，从三分类法到五分类法的各种型号仪器都有大量用户其仪器型号种类丰富，功能和测定参数各异，其各种仪器间均有近似的检测原理，但在结合特定的功能以达到不同的分析目的方面，其原理和所用试剂又有不完全相同之处。

本文以目前其最高配置的XE-2100型血细胞分析仪为例说明其在白细胞计数和分类方面的原理和特点 Sysmex XE-2100在白细胞分类上采用半导体激光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术进行白细胞计数和分类半导体激光照射在通过鞘流技术处理的细胞上，可根据每个细胞所产生的三种信号来鉴别细胞类别前向散射光（FSC）信号可反应细胞体积大小；侧向散射光（SSC）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内含物的信息；侧向荧光（SFL）强度信号则用于分析细胞内脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量 在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类，两个通道均采用激光和鞘流进样的方式测定DIFF通道： STROMATOLYSER-4DL试剂中的表面活性剂可以溶解掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔；然后第二种试剂 STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞器结合，在经过波长633nm的激光照射，产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比STROMATOLYSER -4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散射光信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。

这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞清楚的分离开在DIFF散射图当中可以得到白细胞的四个分群（LMNE） WBC/BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的通道，因为嗜碱性粒细胞数量非常少，因此必须采用特殊技术处理STROMATOLYSER –FB是一种酸性试剂，可将红细胞和血小板形成淡影化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态，然后采用前向散射光（FSC）信号和侧向散射光（SSC）信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来前向散射光与细胞体积测定相关，侧向散射光与裸核后的细胞结构复杂性有关在这个通道中可以获得白细胞总数和嗜碱性粒细胞的数量 血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图特征(2)核心提示:仪器在幼稚粒细胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI检测通道中主要应用射频（RF）技术和直流电阻抗法（DC）这个测定通道根据幼稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质少的现象，在稀释液中加入硫化氨基酸（IM试剂），仪器在幼稚粒细胞分析上有特殊的IMI通道，在IMI检测通道中主要应用射频（RF）技术和直流电阻抗法（DC）这个测定通道根据幼稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质少的现象，在稀释液中加入硫化氨基酸（IM试剂），由于占位不同，结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多，对溶血剂有抵抗作用，对幼稚细胞具有保护作用。

当加入溶血剂后成熟细胞易被溶解掉，而幼稚细胞不易被溶解破坏，可通过电阻法检测出来射频技术用于测量细胞核的大小和颗粒的多少，而直流电信号可反应出细胞体积的大小 在有核红细胞计数上通过专门的有核红细胞检测程序和专用通道-NRBC通道，在处理标本时加入STROMATOLYSER－NR专用试剂，它能使成熟红细胞溶解又可保持有核红细胞的核结构，同时也将白细胞保持完好STROMATOLYSER－NR试剂中的聚次甲基荧光染料可渗透进入白细胞膜内，将白细胞和有核红细胞的核染色通过检测荧光强度得到：白细胞核大荧光强度高，有核红细胞核小，荧光强度低，正常红细胞无细胞核和破碎，荧光强度极低根据荧光强度差和前向散射光信号测定的细胞体积差，可将有核红细胞从其他细胞群中区分出来 图5 Sysmex XE-2100 的幼稚细胞通道和有核红细胞通道散点图 该仪器在红细胞和血小板的计数和分析上仍然沿用了经典的电阻抗方法，在血红蛋白测定上采用了无剧毒物质的SLS溶血剂比色法 3 激光散射和细胞化学染色技术 最早采用该技术的是Technicon公司的H1,H3型，现在的最新型为西门子公司的Advia120型和2120型（2007年以前为Bayer公司产品）。

他是一款开发比较早的高等级仪器，其在白细胞分类上采用了过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类在红细胞和血小板分析都采用了双角度激光法在仪器的管路、电磁阀门、反应杯上采用了独特设计的集成液流版管路系统，是目前血细胞分析仪中所独有和特有的技术 集成液流板实际上是将各种管路和电磁阀门、反应杯等血球计数仪的常用硬件进行综合处理，系统化，微小化，透明化和集成化形成的集成板被放置在仪器的明显部位，方便观察，并具一定的美观效果其另一特点则是细小的管路和反应杯可是标本和试剂用量明显减少 图6 Advia 120的集成液流板 在白细胞分类上，该仪器采用两个通道进行，一个为过氧化酶检测通道，另一个为嗜碱细胞检测通道 过氧化酶反应（peroxidase，POX）是血涂片染色的一个常用细胞化学染色方法，用于鉴别原始细胞与成熟的粒细胞，鉴别粒细胞与非粒细胞染色后的细胞内无蓝黑色颗粒出现为阴性反应，出现细小颗粒或稀疏样分布的黑色颗粒为弱阳性反应，出现黑色粗大而密集的颗粒为强阳性反应过氧化物酶主要存在于粒细胞系和单核细胞系中，各类白细胞对过氧化物酶的反应是这样的：早期的原始粒细胞为阴性，早幼粒以后的各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟过氧化酶含量逐渐增强，中性分叶核粒细胞会出现强阳性反应，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶反应，嗜碱粒细胞不含此酶呈阴性反应。

在单核细胞系统，除早期原始阶段外，幼稚单核和单核细胞会出现较弱的过氧化物酶反应淋巴细胞、幼稚红细胞、巨核细胞等都为过氧化物酶阴性反应Advia 120/2120血细胞分析仪的过氧化酶（Perox）检测通道就是根据这个原理设计的，它检测每一个通过流动计数池中的白细胞，经过激光照射所产生的过氧化酶散射光吸收率，来当然试剂和辅助试剂均进行了改良 在Perox通道所产生的散点图，横轴表示在5°-15°激光散射获得的细胞过氧化物酶含量情况，纵轴是低角度散射光测量的细胞体积大小在此通道内细胞被分为五类1）过氧化酶最强阳性的嗜酸性粒细胞；2）过氧化酶强阳性的嗜中性分叶核粒细胞；3）体积较大、过氧化酶弱阳性的单核细胞；4）体积较小、过氧化物酶阴性的淋巴细胞；5)体积大于淋巴细胞且过氧化物酶阴性的未染色大细胞，此类细胞增加提示幼稚或原始的各类细胞可能出现 在嗜碱细胞（Baso）通道中采用的检测原理是：专用的嗜碱细胞试剂（Baso）将除了嗜碱细胞以外的白细胞除去细胞膜，使其裸核化并体积变小，仅将嗜碱性粒细胞保持原有状态，体积明显大于其他类的白细胞在散点图上处于上面区域的为嗜碱性粒细胞；散点图的横坐标可表示细胞核结构的复杂性，处于左侧的为单个核的细胞群，包括单核细胞和淋巴细胞；处于右侧的为分叶核细胞；中间部位则考虑为杆状核细胞；左下端为单个核的原始细胞区。

图7：ADVIA 120/2120仪器Perox通道和Baso通道散点图 该仪器在红细胞、血小板的测定上也采用了光学检测技术通过激光照射扫描每个通过Flowcell的红细胞，低角度散射光（2 °~3 °）用于测量细胞体积；高角度(5°～15°)散射光测量每个红细胞内的血红蛋白浓度（CH）和血红蛋白含量平均值CHCM这两个值不受红细胞数量和血红蛋白测定的影响还可根据每个红细胞内血红蛋白浓度，计算出红细胞内血红蛋白分布宽度（HDW）值其根据红细胞在体积大小和单个红细胞内血红蛋白含量的分析，将红细胞划分为9个区域，得到红细胞体积和色素含量分布的九分图，也是该仪器在红细胞分析方面独有的特色，根据红细胞分布情况可初步判断疾病类别（下图中）在血小板计数分析上也同样采用了二维光散射分析法，即可获得血小板体积大小，可测量1~60fl内的各种大小不同的血小板，还可对血小板内容物含量（MPC）进行测定血红蛋白测定采用连续流动比色法和红细胞散射光直接测定法两种方法，有助于高脂血和高胆红素血标本的血红蛋白测定准确性图8：ADVIA 120/2120 红细胞散点图（左）和血小板散点图（右） 4 双鞘流技术和细胞化学染色法 ABX是法国生成血细胞分析仪器的著名厂家，其生产的全自动血细胞分析仪Pentra @nt。