005%环孢素滴眼液稳定性的长期试验考察.doc

0. 05%环孑包素滴眼液稳定性的长期试验考察1.前言环泡素(Cyclosporine, CS)是一种真菌源性、由11个氨基酸组成的亲脂性 环状多肽类物质，也是一种高效免疫抑制剂它广泛地应用于器官移植和多种自 身免疫性疾病的治疗中山，也是国际上认可的可以治疗干眼症的处方药0其药 理作用主要通过选择性、可逆性地抑制T淋巴细胞而实现，通过转导作用，作 用于T细胞活化过程中信号，抑制神经钙蛋白，进而抑制T细胞增长与分化⑶， 最终达到免疫抑制效果在临床上多用于治疗器官移植后的免疫排斥反应、类风 湿性关节炎⑷等自身免疫疾病，并且可提高存活率环孑包素用于眼表疾病也具有 显箸的疗效其在眼科的应用分为全身用药和局部用药两种方式然而全身用药 受到血-眼屏障等因素不易进入眼内，并且会带来严重的不良反应⑸，因此多为 眼局部用药角膜移植排斥反应是由供体角膜的特殊抗原引起的一种炎性反应环孑包素作 为一种强效免疫抑制剂，可有效抑制角膜移植后的免疫排斥反应⑹，在临床的治 疗方面仍以糖皮质激素和环孑包素为主，但是长时间应用激素会产牛多种不良反 应环孑包素抑制T细胞由Go期向G］期转变，从而抑制T淋巴细胞的抗原呈递 并抑制白介素2和*干扰素的产生，减轻术后的排斥反应⑺。

蚕蚀性角膜溃疡又名Mooren*s溃疡，是一种慢性、进行性、疼痛性角膜溃 疡，初发于角膜周边部位，沿角膜周边部延伸，并向角膜中央匍行发展，最终累 及全角膜术后常规应用激素和环砲素滴眼液及环磷酰胺等免疫抑制剂药物治 疗该术后药物维持治疗研究结果⑻证明局部环孑包素滴眼液单独或联合板层角膜 移植术可以有效治疗难治性蚕蚀性角膜溃疡腺病毒感染引起的流行性角膜结膜炎(Epidemic keratitis conjunctivitis, EKC)是一种世界性广泛流行的眼部传染病，但可通过自身免疫系统的建立，很 快自愈其临床特点是急性滤泡性或假膜性结膜炎，伴有角膜上皮下浸润，常由 免疫反应所引起通常需要历时一定时间才会吸收，长达数月、甚至数年溃疡不 会形成⑼，如果瞳孔区发生了病变，定会对该病人的视力造成的伤害较为严重 Jenguoj等报道应用环孑包素联合糖皮质激素点眼对其进行治疗较为理想，应用环抱 素进行治疗会显得更加有效、安全、无副作用此外，环孑包素多用于治疗临床中常见的干眼症(DES)l，1J,干眼症多为种复杂 原因所致泪液质和量及动力学的异常从而导致泪膜不稳定性和或眼表面异常、并 伴有眼部不适症状的一类疾病。

在临床方面用药效果较好，可以有效缓解干眼等 不适症状，H不良反应小，可以长期使用干眼症又名角结膜干燥症(KCS), 是因为眼表泪液减少、黏液分泌异常等原因引发的泪液蒸发较多，分布异常的综 合征其大致可分为四种类型：①由于泪腺功能低下所致的水样夜缺乏性干眼病;②由于沙眼、化学伤所致的黏性蛋口缺乏性干眼病；③由于眼睑缺损、配带角膜 接触镜等导致泪液分布不均匀而引起泪液动力学异常；④由于睑板腺功能障碍引 起脂质缺乏性干眼症；在普通人群中的发病率为0.3%ll2J,干眼症的治疗应着手 于去除病因，减少眼表和泪腺的炎症，改善泪膜的结构和功能DES的发病率与多种因素有关，，其中50岁以上女性患病率约为男性的2 倍在某些疾病中，其发病率更高，如在糖尿病患者和风湿性关节炎患者中分 别为54.3%和46.7%113Jo环砲素滴眼液疗效好，且无全身性不良反应，近年来在 欧美国家临床得到了广泛应用对丁•斯耶格伦氏综合征(Sjorgrens syndrome)这 类与炎症相关的干眼症，可使用环砲素等消炎药进行治疗卩出各类临床试验也 证明，使用环苞素滴眼液能增加患者眼泪量环砲素较人造眼泪的疗效要好，某 些患者经人造眼泪治疗数月无效，但使用环抱素后效果显著，且增强了患者角膜 及结膜知觉的敏感度。

患有家族性淀粉样多发性神经病变的患者，通过环抱 素治疗后干眼症状明显减轻，且无任何不良反应［⑹环抱素的作用是有效缓解 慢性干眼症潜在的炎症过程，局部应用环抱素能阻止某些患者干眼进程，对治疗 干眼症有良好的疗效滴眼剂是眼病治疗常用途径环苞素具有脂溶性，易溶于植物油中，现如今 环砲素的眼用剂型为普通乳剂型滴眼剂由丁环砲素的相对分子质量大且呈疏水 性，眼内通透性差，难以达到治疗水平，影响疗效微乳(microemulsion, ME)系指粒径为10〜100nm的乳滴分散在另一种液 体介质形成的热力学稳定的胶体溶液微乳一般在一定条件下可自发(或轻度振 摇)形成，其乳滴多为大小比较均匀的球形，呈透明或半透明状微乳是由油相、 表面活性剂(SF)、助表面活性剂(CoSF)以及水相组成的，在一定温度长时间 放置或离心(1300 r/min, 30min)均较稳定我们按照《中国药典》关于溶液颜色检查法的方法、澄清度检查法以及制剂 稳定性指导原则的要求对该制剂的稳定性进行长期试验考察按药物制剂稳定性 重点考察项目，考察滴眼液性状、可见异物、含量、PH值、有关物质及无菌情 况为0.05%环砲素滴眼液的生产、包装、贮存、使用条件提供科学依据。

2仪器与试药 2.1仪器数显无极恒速搅拌器 （巩义市英峪予华仪器厂）日本岛津产LC-1OAVP型高效液相色谱仪SPD-10AVP型紫外检测器LC-10AVP 泵CTO-10AVP柱温箱Class-up工作站Shim-packvp-ODS 色谱柱（150mm*4.6mm）隔膜真空泵GM-0.33 电子分析天平AG135 实验室pH计FE20Model C3860A 超声仪渗透压摩尔浓度测定仪SMC 30B 针头式微孔滤膜过滤器 一次性使用无菌注射器H本岛津产紫外分光光度计UV-2450（夭津市津腾实验设备有限公司）（梅特勒-托利多仪器有限公司）（梅特勒-托利多仪器有限公司）（CBL Photoelectron Technology Co. Lid.）（天河医疗仪器有限公司）（天津市双吉色谱仪器经营部）（浙江京环医疗用品有限公司）灯检装置A. 带有遮光板的H光灯光源B. 不反光的黑色背景；C. 不反光的白色背景和底部D. 反光的白色背景（指遮光板内侧）药品光照试验箱温度XMTA908光照强度XMTA808 （重庆汉瞻仪器有限公司）调温调湿箱2.2试药（天津天宇机电有限公司）环砲素环砲素对照品 大豆油聚乙二醇PEG400聚山梨酯80轻苯乙酯甲醇乙膳（福建科瑞药业有限公司，批号:140201 （N））（中国药品生物制品鉴定所，含量为98.8%）（新兴（铁岭）药业有限公司，批15050106-2-01）（江四益普生药业有限公司，批号：20141001）（四川金山制药有限公司，批号:150502）（广州市广谱医药有限公司，批号:141102）（色谱纯，天津市康科徳科技有限公司）（特级品，天津市康科徳科技有限公司）磷酸 （化学纯，石家庄市试剂厂冀都化学试剂有限公司）水为纯化水三乙胺为分析纯0.05%环砲素滴眼液 （自制三批：160203,160204,160205）色谱用试剂为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为注射用水。

3方法3.1样品的制备：取疑苯乙酯0.3g加入700ml纯化水，加热使之溶解，加入60ml聚乙二醇・400, 搅拌，混匀；取0.5g环砲素至乳钵中，加10ml大豆油，80ml聚山梨酯80,充 分研磨，倒入上述溶液中，快速搅拌，加纯化水至1000ml,混匀，0.45pm微孔 滤膜过滤，无菌分装，即得3.2色谱条件及方法学研究：321色谱条件：色谱柱：Shim-packvp-ODS 色谱柱(150mmM.6mm)流动相：乙膳：甲醇：水：三乙胺（200： 600： 200： 0.5）,用磷酸调pH 到 2.93检验波长：210nm柱温：65 C流速：1.2 ml/min进流量：饱和进样进样量：20|iL322样品预处理:取Cw固相萃取小柱两个，串联使用并将其活化（活化顺序为：甲醇-水-水 -甲醇，每次各5ml）,用5ml的移液管精密吸取样品5ml至小烧杯中，用注射器 全部吸取并缓慢打入小柱，收集滤液，用注射器二次吸取完全，再次通过小柱， 弃去滤液，后用5ml纯化水冲洗杂质，再用乙膳、水的混合液（1： 1）洗脱样品 于10ml的容量瓶中定容，混匀过滤（孔径0.45pm）,作为供试品3.2.3系统适应性实验：用移液管精密量取该样品5ml,按照3.2.2的处理方法操作，再321的色谱 条件下进样，记录色谱图，计算理论塔板数，分离度。

比较标准品、样品和空白 微乳的色谱图324标准曲线的绘制：精密称取环砲素对照品25mg于50ml容量瓶中，用乙睛溶解并稀释至刻度 使成储备液再分别精密移取储备液3, 4, 5, 6, 7ml于10ml容量瓶中，用乙 膳稀释至刻度，配成0.15,0.2,0.25,0.3,0.35pg/ml的溶液，并按上述色谱条件分别 进样，记录对应的峰面积以峰面积（Y）与对照品浓度（X）回归，观察其是 否呈良好的线性关系，计算其回归方程3.3制剂稳定性的长期试验考察：3.3.1溶液的性状:本品为淡黄色澄明液体照《中国药典》溶液颜色检查法，配制黄绿色调标 准比色液分别取6C2C条件下，于0月，1月，2月，3月的环砲素滴眼液样 品直接与标准比色液比较，样品与标准色体积相等，同置白色背景前，平视观察 3.3.2鉴另I」在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间与对照品主峰的保 留时间分别一致3.3.3无菌情况的检测：取本品0.05%环抱素滴眼液，采用薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白陈水溶 液冲洗（每膜不少于100ml）,以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依照法检查（中 国药典），应符合规定3.3.4pH和渗透压的检查：本品pH值应在5.0〜6.5之间，渗透压摩尔浓度应在290〜430mOsmol/kg范 围内。

分别取6C2C条件下0月，1月，2月，3月的0.05%环范素滴眼液样品 适量，测定其pH值、渗透压并观察制剂理化性质是否稳定3.3.5可见异物检查：分别取6 C 2 C条件下0月，1月，2月，3月的环砲素滴眼液样品20支， 去除容器标签，把容器外壁清洁干净，调节光照度至2000〜30001X,将供试品置 于遮光板边缘处，并在人眼的清晰观测距离内（约为25cm）,分别置于黑色和白 色背景下，手持供试品颈部轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬 浮（但应避免产生气泡），轻轻翻摇后即用目检视，重复3次，总时限为20秒样品制剂在静置一定时间后轻轻旋转时应无烟雾、状微粒柱，且没有检岀金 屈屑、玻璃屑、长度或最大粒径超过2mm的纤维和块状物等明显可见异物；也 没有检查出微细可见异物（如点状物、2iwn以下的短纤维和块状物等）根据检 测结果，观察该0.05%环砲素滴眼液样品的可见异物检查是否符合标准3.3.6样品含量的测定：取0.05%环砲素滴眼液样品，按照3.2.2样品预处理方法项下操作，供试品 20（41进样，使用外标法根据峰面积计算样品的含量要求该制剂含环砲素 （C62H111N11O12）的含量应在90%〜110%的范围内。

3.3.7有关物质检测：分别取6C2C条件下0月，1月，2月，3月的0.05%坏孑包素滴眼液样品适 量，进行精密称定按照3.2.2的操作步骤完成样品预处理后，然后用乙膳定容， 制成每1ml中含0.25mg的溶液，作为供试品溶液；同理制成每1ml中约有2.5pg 的溶液，作为对照液照含量测定项下的色谱条件，取对照液20pl注入液相色 谱仪，调节灵敏度。