基因的表达与调控(上).ppt

第七章 基因的表达与调控（上）——原核基因表达调控模式,1.原核基因表达调控总论 2. 乳糖操纵子与负控诱导系统 3. 色氨酸操纵子与负控阻遏系统 4. 转录水平的其他调控方式 5. 转录后调控,主要内容,7.1 原核基因表达调控总论,□基因表达（gene expression）：从DNA到蛋白质或功能RNA的过程 □基因表达调控（gene regulation或gene control）对基因表达过程的调节 □基因表达调控主要表现在两个方面： 转录水平的调控（transcriptional regulation） 转录后水平的调控（past-transcriptional regulation）1）mRNA加工成熟水平上的调控（differential processing of RNA trscript）2）翻译水平上的调控 □原核生物中，营养状况（nutritional status）和环境因素（enviromental factor）对基因表达起着举足轻重的影响；在真核生物中特别是高等真核生物激素水平（hormone level）和发育阶段（developmental stage）是基因表达调控的最主要的手段。

7.1.1 原核基因调控分类 □负转录调控（negative transcription regulation）调解基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用根据其特征又分为：1）负控诱导：阻遏蛋白（活性）不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录2）负控阻遏：阻遏蛋白（非活性）与效应物结合时（阻遏蛋白转变为活性状态）结构基因不转录 □正转录调控（positive transcription regulation）调解基因的产物是激活蛋白（activator）1）正控诱导系统：诱导物的存在使激活蛋白处于活化状态2）正控阻遏系统：效应物的存在使激活蛋白处于非活化状态,负控诱导系统,正控诱导系统,负控阻遏系统,正控阻遏系统,7.1.2 原核基因调控的主要特点 1. 可诱导调节指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态 转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化例子：大肠杆菌的lac操纵子可诱导基因；可诱导酶；酶的诱导合成 2. 可阻遏调节这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中， 由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。

例子：大肠杆菌的Trp操纵子可阻遏基因；可阻遏酶；可阻遏现象；阻遏物 □一般规律：可诱导的操纵子总是一些编码糖和AA分解代谢蛋白的基因，这些操纵子常常是关闭的；可阻遏基因正好相反，他们是一些合成各种细胞代谢过程中所必需的小分子物质的基因，这些基因常常是打开的7.1.3 弱化子对基因活性的影响在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的AA-tRNA的浓度， 是转录调节中的微调整当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段 核苷酸被称为弱化子 例子：Trp操纵子的弱化作用 7.1.4 降解物对基因活性的调节在葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖等诱导 物，与其对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶，这种现象 称为葡萄糖效应或降解物抑制效应降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的 7.1.5 细菌的应急反应应急反应的信号：ppGpp和pppGpp产生这两种物质的诱导物是空载tRNA7.2 乳糖操纵子与负控诱导系统,□操纵子模型操纵子：基因表达的协同单位指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元操纵子学说：关于原核基因结构及其表达调控的学说 □法国巴斯德研究所Jacob和Monod在1961年提出 □操纵子的组成1）结构基因2）调节基因（I）3）控制部位：可接受调节基因产物的调节。

包括启动子（P区）和操纵基因（O区）调节基因 控制部位 结构基因,7.2.1 乳糖操纵子模型 1）Z、Y、A基因的产物由同一条多顺贩子的mRNA分子所编码Z基因：编码β-半乳糖苷酶Y基因：编码β-半乳糖苷透过酶A 基因：编码β-半乳糖乙酰基转移酶 2）该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶的高效表达 3）操纵区（O）是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点 4）当阻遏物与操纵区结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制 5）诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵区结合，从而激发lac mRNA的合成 □这一模型仅解释了lac体系的负控系统，在lac操纵子同样存在正调控！,β-半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,7.2.2 lac操纵子的影响因子 1. lac操纵子的本底水平表达 □问题： 1）诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，透过酶的合成又需要诱导第一个诱导物是如何到达细胞的？ 2）乳糖（G-1,4-gal）并不与阻遏物结合，真正的诱导物是异乳糖（ G-1,6-gal ）而异乳糖是在β-半乳糖苷酶的催化下由乳糖形成的。

乳糖诱导β-半乳糖苷酶的合成需要β-半乳糖苷酶的预先存在！ □对这一现象的解释：在非诱导状态下有少量的lac mRNA合成（大约每个世代中有1-5个mRNA 分子）这种合成被称为本底水平的永久型合成,□研究诱导作用时很少适用乳糖，而用乳糖类似物 1）异丙基巯基半乳糖苷（IPTG） 2）巯甲基半乳糖苷（TMG） 3）在酶活性分析中，常用显色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG） □他们都是高效诱导物，但不是半乳糖苷酶的底物，因此称为安慰性诱导物,2. 大肠杆菌对乳糖的反应,本底水平表达 （几个分子的β- 半乳糖苷酶和透过酶）↓乳糖 在透过酶作用下，lac进入细胞，又在β- 半乳糖苷酶作用下乳糖转变为异乳糖↓ 异乳糖与结合在操纵区上的阻遏物结合导致阻遏物失活↓lac mRNA开始合成,3. 阻遏物 lacI 基因产物及功能 □ lacI 基因产物为阻遏蛋白，由4个相同亚基，每个亚基均含有347AA，并能与1分子IPTG结合 □lac阻遏物 mRNA是在弱启动子控制下永久合成的 □当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内不能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个 lac 操纵子在这些突变体中不可诱导。

4. 葡萄糖对lac操纵子的影响,□将G和lac同时加入培养基，大肠杆菌在耗尽外源G之前不会诱发lac操纵子 □ G对lac操纵子表达的抑制是间接的 证据：一个大肠杆菌突变株，他在EMP途径 中不能将G-6-P转化为下一步代谢中间物， 这些细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导 合成 □代谢物阻遏效应（葡萄糖效应）葡萄糖的某些降解产物（不是葡萄糖） 抑制lac mRNA合成的现象,G耗尽,（或：有葡萄糖存在时，不论诱导物存在与否，操纵子都没有转录活性，结构基因都不表达）,5. cAMP与代谢物激活蛋白（lac操纵子的正调节） □在大肠杆菌中， cAMP的浓度受G代谢的调节 1）将细菌放在缺乏碳源的培养基中，细胞内cAMP浓度就高； 2）如果在含G培养基中，细胞内cAMP浓度就低； 3）如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行EMP途径（甘油其实可进入EMP途径）的碳源，细胞内cAMP浓度也会很高说明：在EMP途径中位于G-6-P与甘油之间的某些代谢产物是cAMP酶的抑制剂 □大肠杆菌中的代谢物激活蛋白（CAP），或称为cAMP-受体蛋白（CRP）,由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物cAMP- CRP。

□ Crp和cAMP酶基因突变的细菌都不能合成lac mRNACRP和cAMP（两者单独不起作用）都是合成lac mRNA所必需的！,□G会降低细胞内cAMP的水平当G缺乏时，大肠杆菌细胞内cAMP上升，CRP结合到cAMP上 CRP- cAMP结合到紧邻RNA Pol 结合位点上游的lac操纵子Plac上CRP的结合引起DNA链发生90度弯曲，这增强RNA Pol与启动子的结合，使转录效率提高50倍□ 细菌对于cAMP- CRP复合物的需要是独立的，与阻遏体系无关，转录必须有cAMP- CRP复合物结合在DNA的启动子上，是lac操纵子的正调控因子 □ lac操纵子是在负调控和正调控两个独立的调控体系下完成的正调控位点,负调控位点,lac操纵子必须同时在CRP结合位点结合cAMP- CRP和去阻遏状态下 才能高效表达,7.2.3 lac操纵子中的其他问题 A基因及其生理功能A基因：编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶，使β-半乳糖第6位C原子乙酰化 问题：为什么A基因不在乳糖降解中起作用呢？自然界存在很多能被β-半乳糖苷酶降解的β-半乳糖苷分子，其分解产物不能被进一步代谢，很容易在体内积累，是细胞正常生长的抑制物。

而β-半乳糖苷分子（如IPTG）被乙酰化后，不能被β-半乳糖苷酶降解抑制有害物质的积累证据：当有IPTG存在时，I -Oc A- 大肠杆菌的生长速度显著慢于相应的A+株系，其差异仅仅在于IPTG被乙酰化2. Lac基因产物数量上的比较在一个完全被诱导的细胞中β-半乳糖酶： β-半乳糖透过酶： β-半乳糖苷乙酰基转移酶=1：0.5：0.2不同酶在数量上的差异是由于翻译水平上受到调节所致 1）大多数多顺反子mRNA分子，存在一个从mRNA的5’端到3’端的蛋白质合成的梯度当lac mRNA与核糖体脱离，终止蛋白质合成，其发生的频率取决于AUG密码子再度起始翻译的概率靠近mRNA的5’端再度起始的概率大 2）在lac mRNA 分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用3. 操纵子的融合与基因工程操纵子在自然条件下可能发生融合如：lac操纵子与负责嘌呤合成的pur操纵子的偶联7.3 Trp操纵子与负控阻遏体系,Trp的合成分5步完成，有7个基因参与整个合成过程,7.3.1 Trp操纵子的阻遏系统 □由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受G或cAMP-CRP的调控 □当培养基中含有高浓度的trp时， Trp操纵子不表达；当培养基中trp不足时，Trp操纵子表达。

——调节基因trpR的产物称为辅阻遏蛋白，可与trp结合形成有活性的阻遏物与O区结合并关闭trp mRNA转录；缺乏trp时，辅阻遏蛋白失去trp并从O区上解离， trp操纵子去阻遏7.3.2 弱化子与前导肽有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不一致 1）在trp高浓度和低浓度下观察到trp操纵子的表达水平相差600倍，而阻遏作用仅使转录降低70倍 2）使阻遏物失活突变不能完全消除trp对trp操纵子的影响——这种调控机制与阻遏物的控制无关，必定有其他调控机制！ □研究证实，阻遏-操纵机制控制转录的启动，是trp操纵子的粗调开关，还有另外一个系统进行细调控并决定已经启动的转录能否继续下去——弱化作用 □弱化作用：是通过转录到达第一个结构基因之前的过早终止来实现的 □前导区：trpE基因的起始密码前一个162bp的mRNA片段称为前导区其中123-150位碱基序列缺失，trp基因表达可提高6-10倍当mRNA合成起始后，除非培养基中完全没有trp，转录总在这个区域终止，产生一个仅有140nt的RNA分子，终止trp基因转录弱化子（attenuator）：指原核生物操纵子中能显著减弱甚至 终止转录作用的一段核苷酸序列。

该序列 能形成不同的二级结构，利用原核生物转 录与翻译的偶联机制对转录进行调节 □该区域mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型终止子特点,前导肽：前导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，如果翻译起始于 AUG，应该产生一个14AA的多肽，这个假设的多肽称为前导肽 mRNA前导区的序列分析 □具有4个分别以1、2、3和4表示的片段，能以两种不同的方式进行碱基配对 1）1-2，3-4配对：其中3-4配区正好位于终止密码的识别区，为终止构型 2）2-3配对：抗终止子结构,。