流式细胞术的临床应用参考PPT.ppt

流式细胞术在临床上的应用流式细胞术在临床上的应用深圳市人民医院临床医学研究中心深圳市人民医院临床医学研究中心 李富荣李富荣1 第一部分 流式细胞仪（FCM)）工作原理2FCMFCM系统结构系统结构流体系统：样本流、鞘液流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、光学系统：激光光源、分光镜、滤片、 散射光和荧光探测器散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统系统、偏转系统数据处理系统：计算机工作站数据处理系统：计算机工作站3FCMFCM工作原理流程：工作原理流程：样本（血液实体组织）单细胞悬液荧光染料特异染色的样本上机细胞单列通过测量区1.散射光信号2.荧光信号分离、收集、分析、光信号细胞理化特性分析图加入荧光染料激光激发4流式细胞仪的构造及原理流式细胞仪的构造及原理5FCMFCM测量光信号获取与分析测量光信号获取与分析散射光信号●前向散射光(FSC)----细胞大小●侧向散射光（SSC)---细胞粒度（膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量）FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。

SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小6根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易区分二维点图，可以容易区分Lym(R3)Gran(R1)Lym(R3)Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)R1R2Incident Light SourceRight Angle Light Dectector a Cell ComplexityForward Light Detector a Cell Surface AreaR3R2R1根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易的区分出二维点图，可以容易的区分出Lym(R3) .Gran(R1)Lym(R3) .Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)7流式细胞术常用染料及检测波长流式细胞术常用染料及检测波长89荧光染料的发射不同波长荧光染料的发射不同波长10DNA DNA 和和RNARNA荧光探针的理化特性荧光探针的理化特性荧光探针荧光探针 分子量分子量 结合方式结合方式 碱基特异性碱基特异性 激发锋（激发锋（nm) nm) 发射锋发射锋(nm)(nm)P1 668 P1 668 嵌入嵌入 无无 493 630 493 630EB 394 EB 394 嵌入嵌入 无无 482 616 482 616MI 1069 MI 1069 非嵌入非嵌入 G-C 320,445 575 G-C 320,445 575 CA3 1183 CA3 1183 非嵌入非嵌入 GC 320,445 575 GC 320,445 575 HO33258 624 HO33258 624 非嵌入非嵌入 AT 343 480 AT 343 480 HO33342 615 HO33342 615 非嵌入非嵌入 AT 343 455 AT 343 455DAPI 350 DAPI 350 非嵌入非嵌入 AT 540 650 AT 540 6507-AAD 1270 7-AAD 1270 嵌入嵌入 GC 540 655 GC 540 655 AO 370 AO 370 嵌入嵌入 ( (双链）双链） 无无 492 530 492 530 静电（单链）静电（单链） 640 640PY 303 PY 303 嵌入嵌入 ( (双链）双链） GC>AT 549-562 565-574 GC>AT 549-562 565-574 静电（单链）静电（单链）11细胞周期分析细胞周期分析通过荧光探针对细胞周期进行相对通过荧光探针对细胞周期进行相对DNADNA含量的测定，可分析细含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNADNA异倍体异倍体G1SG2GoM12分选系统（分选系统（Sorting)Sorting)依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：●电荷式分选电荷式分选稳定液流测量区液滴形成液滴充电液滴偏转分选收集逻辑电路13电荷式分选电荷式分选14通道式分选通道式分选稳定液流测量区逻辑电路捕获管分选收集15 第二部分第二部分 流式细胞术在临床医学中的应用流式细胞术在临床医学中的应用1617流式临床应用流式临床应用淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析Th1/Th2 肿瘤学肿瘤学HLA-B27PNH 四聚体四聚体血小板活化血小板活化 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫181920212223常常用用淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群报报告告模模式式R24深圳深圳市人市人民医民医院流院流式细式细胞术胞术报告报告单模单模式式25262728293031323334353637HLA-B27通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B-27的平均荧光强度。

如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性3839 Th1/Th2细胞40414243444546 肿瘤学肿瘤学47484950515253545556575859 细胞凋亡细胞凋亡606162636465 移植免疫移植免疫666768697071 四聚体四聚体72Tetramer-原理原理内源性抗原内源性抗原外源性抗原外源性抗原73Tetramer-原理原理MHC Class I-HLA-A274Tetramer-原理原理75Tetramer-原理原理国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-10576HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽限定性肿瘤抗原肽77抗原特异性抗原特异性CTL的分析方法的分析方法51Cr释放实验释放实验PCR法法酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体Tetramer法法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力难以广泛应用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法有限稀释法(LDA)用用Tetramer法研究表明，外周血中仅有法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的的CD8+细胞对细胞对CMV和和EBV特异特异78Tetramer法法Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard)79Tetramer-应用应用感染性疾病感染性疾病HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSVBreast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and LeukemiaDiabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligoEBV and CMV 移植移植 自身免疫性疾病自身免疫性疾病肿瘤肿瘤80感染性疾病感染性疾病Tetramer-应用应用-例证例证Ø含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关Ø慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者Ø用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集ØGVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败---HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果ØHLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力 移植移植肿瘤肿瘤818283 第三部分第三部分 定量流式细胞术定量流式细胞术84 定量流式细胞术的概述定量流式细胞术的概述定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。

对计量，而不是阳性细胞的相对百分数原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及治疗等具有重要意义治疗等具有重要意义85血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit86特点特点Ø可定量与血小板相关的任何抗原(如CD41, CD61, CD42a等)Ø免洗Ø间接法Ø一抗亚型为IgG1, IgG2a或IgG2bØ定量范围宽(500-90,000 分子/血小板 )Ø定量准确，CV值(变异系数)小血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit87标准曲线标准曲线血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit- PLATELET Calibrator Kit88结果结果血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit89CD41/61复合物变形与复合物变形与Firbrinogen结合，为结合，为初期血栓初期血栓形成的关键步骤形成的关键步骤PLATELET Fibrinogen Kit90应用应用Ø心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等)Ø监测抗凝集治疗(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等)Ø检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能力Ø血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力Ø血小板活化状态(ex vivo)标本处理标本处理PLATELET Fibrinogen Kit91白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit92特点特点Ø可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等)Ø单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数)Ø多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+ T细胞上CD28分子数)Ø全血和分离的细胞(如细胞株等)均可Ø间接法Ø一抗亚型为IgG1和IgG2aØ定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞 )Ø定量准确，CV值(变异系数)小白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit93标准曲线标准曲线白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit94结果结果白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit95Blood Dendritic Cell Enumeration KitDCDC作用作用：1.树突状细胞（dendritic cell,DC）为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与MHC二类分子结合向其它免疫活性细胞传递抗原信息。

2.骨髓样DC（MDC）和淋巴样DC(PDC).在诱导和调控免疫应答方式上完全不同：首先它们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反应，即使受到相同的抗原刺激骨髓样DC（MDC）与Th1效应相关,而淋巴样DC（PDC）与Th2效应有联系； 已经应用的领域包括已经应用的领域包括：：1）SLE病人病情和疗效观察；2）AIDS病人免疫机能分析；3）病毒性肝炎病人免疫状况研究；4）疫苗研究96特点特点简便、简便、快捷、快捷、绝对计数绝对计数DC亚群数亚群数/ml9798最新技术最新技术计数血液中循环内皮细胞的标准方法计数血液中循环内皮细胞的标准方法99循环内皮细胞循环内皮细胞(CEC)增加于增加于CELLQUANT FF-CD146Ø急性冠状动脉综合征Ø血小板减少性紫癜Ø镰刀细胞贫血Ø败血症Ø狼疮Ø肾病综合征Ø器官移植排斥Ø手术创伤Ø癌症传统方法传统方法显微镜检，手工计数费时，费力，无法标准化100新技术新技术—新标准新标准CELLQUANT FF-CD146Ø免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合Ø仅需1 mL血Ø整个过程不到1个小时Ø灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞Ø重复性好，室间差(Interlaboratory CV)小101方法方法CELLQUANT FF-CD146Ø将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育Ø富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶) (确定有核细胞) CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰) CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点) 标准浓度微球(用于绝对计数)Ø流式分析(循环内皮细胞鉴定) 有核细胞(PI+); CD45-; CD146+;前向散射角(FSC)范围宽102CELLQUANT FF-CD146PI-CD45 FITC103CELLQUANT FF-CD146PI-CD45 FITC104CELLQUANT FF-CD146105CELLQUANT FF-CD146106CELLQUANT FF-CD146107 第四部分第四部分 在医学研究中的应用在医学研究中的应用108优点：1.1.临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具2.2.可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价3.3.可与世界研究水平同步可与世界研究水平同步4.4.临床医师不需亲自参与试验过程临床医师不需亲自参与试验过程5.5.研究工作周期短研究工作周期短109110111。