生物化学实验二-纸层析法分离氨基酸1800字.docx

    生物化学实验二纸层析法分离氨基酸1800字    生命学院 生物化学实验实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、 实验目的1、 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分2、 学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸二、实验原理⑴ 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离⑵ 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：⑶ Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离⑷ 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关本实验利用纸层析法分离氨基酸三、 实验器材a) 大烧杯（5000mL）：1只/组b) 毛细管c) 喷雾器：公用d) 培养皿：1只/组e) 层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组f) 直尺、铅笔：自备g) 电吹风：1只/组h) 托盘、针、白线：1套/组i) 手套：1双/组j) 塑料薄膜：公用k) 小烧杯：50mL，1只/组四、 实验试剂（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。

2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液1生命学院 生物化学实验五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图3）点样：用毛细管浸液取样，点在这四个位置上同一位置上需点2～3次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧 ，边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。

向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封当上升到12～15cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干5）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见右图6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-27）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师计算 ： Rf= 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离六、注意事项⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)2生命学院 生物化学实验⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。

滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定3第二篇：生物化学实验 氨基酸的纸层析法 1900字实验 氨基酸的纸层析法一、目的了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法二、原理以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。

这种方法称为双向层析法本试验主要介绍的是单向层析法其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成三、实验仪器1、 新华滤纸2、 层析缸3、 细线4、 点样管5、 橡皮筋6、 电吹风7、 喷雾器四、实验试剂1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中五、试验步骤1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。

书上图谱横着看）六、实验结果1.标准氨基酸单向上行层析法定性、定量测定：将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点甘氨酸层析点中心到原点的距离：0.4cm苯丙氨酸层析点中心到原点的距离：3.2cm原点到溶剂前沿的距离:10.8cm在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296实验图像：七、实验分析由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点注意事项：1. 在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳防止扩散面积过大，使展层效果不佳或直接影响实验结果否则分离不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。

2. 注意点样线要高于层析液面防止点样氨基酸溶解于层析液中滤纸不要贴在层析缸璧上防止滤纸左右两端展层速度过快，影响实验结果3. 均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断4．取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸并尽可能少接触滤纸在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在试验台上，以防止污染5.展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿6.在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行8.风温度不宜过高，否则斑点变黄9.影响Rf值的因素有：①物质本身的化学结构；②展层所用溶剂系统；③展层剂pH值；④展层时的温度；⑤展层所用滤纸；⑥展层的方向(横向，上行或下行)＋   -全文完-。