可统稿—第二编 第三章 第四节 荧光免疫技术——苏——于——李.doc

可统稿—第二编 第三章 第四节 荧光免疫技术——苏——于——李第四节荧光免疫技术 荧光免疫技术（fluorescenceimmunoassay）是在利用抗原抗体反应的特异性及荧光物质检测的敏感性和直观性的基础上，结合生物化学.免疫学和显微技术的一种免疫分析技术它是发展最早的标记免疫技术之一，1941年，Coons等首次通过异硫氰酸荧光素标记抗体，而检测到小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌的多糖抗原1970年，荧光免疫测定技术（fluorescence immunoassay，FIA）也发展建立起来，随着一系列新型仪器及新方法的问世，荧光免疫技术逐渐标准化.定量化和自动化，成为科学研究.检验医学中应用广泛的测定方法荧光免疫技术包括荧光抗体技术和荧光免疫测定技术两种类型：①荧光抗体技术：荧光抗体技术是在细胞及组织切片或其他标本中，利用荧光抗体对其抗原或抗体进行定位和定性测定利用荧光显微镜直接观察结果，则称为荧光免疫显微技术；共聚焦显微技术是在荧光显微技术的基础上发展起来的又一技术；利用流式细胞仪自动分析检测，则称为流式荧光免疫技术②荧光免疫测定技术：荧光免疫测定技术是体液标本中，对其抗原或抗体进行定量检测。

荧光酶免疫分析.荧光偏振免疫测定.流式荧光技术等均属于此类型一.荧光免疫显微技术 荧光免疫显微技术是在固定组织及细胞中，以荧光显微镜作为检测工具，利用荧光素标记的特异性抗体或抗抗体，来检测抗原或血清中抗体的一门技术，通常用于定性和定位测定此方法有高度特异性，直观性强但由于荧光易消退，因此难以制备成永久性标本，且非特异性荧光会干扰测定结果荧光免疫显微技术可根据标记物和反应程序的差异，分为四种类型：①直接法：特异性抗体被荧光素标记后，直接滴加于待测标本上，与相应抗原相互反应此方法常用于皮肤活检.肾活检的免疫病理检查及病原微生物的快速检测②间接法：首先，以待测基质标本中的抗原与相应抗体（第一抗体）反应，再加入被荧光素标记的抗抗体（第二抗体）来结合第一抗体，其荧光现象可用于检查抗原或抗体此方法常用于各种自身抗体的检测③补体结合法：首先，待测基质标本中的抗原与抗体反应，形成抗原抗体系统，但其干扰因素多，操作复杂，每次实验都需要新鲜补体荧光免疫显微技术主要由制作标本.荧光抗体的染色及荧光显微镜的检查等步骤组成，以直接法为例荧光免疫显微技术对于抗原的鉴定及定位，以观察标本上荧光抗体的染色结果为主，因此，在标本制备的过程中，需在力求保持抗原完整性的基础上，使其在染色及洗涤等过程中不发生变性和溶解，也不会扩散至组织间隙或邻近细胞中去。

同时，标本的切片需要尽量薄些，以便于抗原与抗体的接触和镜检标本中存在的会对抗原抗体反应产生干扰的物质要充分洗去，若标本有传染性的则需注意安全常见的临床标本主要有三大类，即细胞.组织和细菌，不同的标本可制作成涂片.切片或印片组织材料可被制备成冷冻切片或石蜡切片冷冻切片具有大量保存抗原.操作简单.自发荧光较少的优点，但其组织结构欠清晰而石蜡切片对于组织细胞的精细结构则显现清楚，因此其可用于回顾性的研究，但其对抗原的保存量较冷冻切片低.操作繁琐.非特异性的荧光反应强.结果不稳定组织材料也可被制成印片，其方法是以洗净的玻片在组织切面轻压，使玻片粘上1至2层组织细胞细胞或细菌材料可制成涂片，涂片需薄而均匀培养的细胞可待细胞培养生长并在玻片上形成单层，细胞经悬浮培养后可制成涂片，还可利用病毒或病人标本的感染的细胞进行细胞培养，并用荧光抗体染色法来检测病毒除活细胞外，在染色前其他标本片应以适当的方式固定常用的固定剂为丙酮和乙醇，以冷丙酮对冷冻切片的固定效果最好，而加95％冰乙酸的乙醇对于抗原涂片的固定效果较为理想固定时间为5～15min制备好的标本应尽快的染色检测，或于resolvedfluorescenceimmunoassay，TRFIA）。

均相荧光免疫测定法，是在抗原抗体反应后，结合的标记物即Ab*Ag失去荧光特性，则在不需进行Ab*Ag与Ab*分离的情况下，通过直接测定游离的Ab*量，推算出标本中的Ag量，此测定法包括底物标记荧光免疫测定（substrate106倍，利用此特点并结合时间分辨荧光分析仪来延缓测量时间，可将标本中非特异性荧光的干扰排除，从而仅得到特异性荧光同时镧系元素荧光光谱具有激发光与荧光波长差别显著（Stokes位移大）的特点，而且被激发的荧光光带窄.发射峰尖锐，因此可使仪器在极窄的波长范围内进行测定利用镧系元素上述两种特性，通过延迟时间和分辨波长即分辨特异性及非特异性荧光，从而将非特异性荧光的干扰几乎消除，仅测得特异性荧光发出的信号时间分辨荧光分析仪由于采用脉冲光源，照射样品后可短暂熄灭，并结合电子设备进行控制延缓时间，当非特异性荧光的本底均衰退后，再对样品中长寿命镧系荧光测定时间分辨荧光免疫测定的技术类型，大致包含以下五种：①固相抗原竞争法：固相抗原即大分子抗原或半抗原抗体复合物分离③固相双位点夹心法：此方法需利用两种不同抗体，这两种抗体是针对抗原中不同决定簇的在实验中，一种包被在固相上，另一种则用Eu3+标记。

待测抗原首先与固相抗体发生结合反应，洗涤后加入Eu3+标记的抗体，温育，使固相抗体Eu3+标记抗体复合物形成，再次洗涤充分后加入增强液，测定荧光强度，因此待测抗原浓度与所测得的荧光强度呈正比④间接法：待测标本中的抗体与固相抗原结合后，固相抗原抗体复合物结合，洗涤去除未结合的抗抗体，加入增强液，进行测定此方法是检测抗体常用的方法⑤捕获法：由于血清或血浆中会同时存在针对抗原的特异性的IgM及IgG，IgG会对特异性IgM的测定产生干扰，因此在测定特异性IgM时需将特异性IgG去除首先，将固相载体与抗IgM抗体温育结合，去除未结合的抗体，再加入稀释的待测标本，温育结合，捕获标本中的IgM，洗涤后加入特异性抗原，温育结合并洗涤，最后加入镧系元素标记的特异性抗体，洗涤并加入增强液，进行测定T RFIA方法是以超微量物质为检测对象的免疫分析技术，其标记物制备过程简单.有效期长，分析速度快，且此方法特异性强，灵敏度高，标准曲线范围宽，有很好的发展前途在临床上常用在以下几个方面：①免疫学：测定各种补体及细胞因子等；②微生物学：测定各种细胞和病毒抗体和抗原；③分子生物学：可使核酸杂交过程变得快速.简单；④激素方面：定量检测各种激素；⑤肿瘤方面：定量检测各种肿瘤标志物；⑥其他方面：检测体液各种微量蛋白。

二）荧光偏振免疫测定 荧光素经偏振光照射后，会跃入激发态，其在回复至基态后释放出光子，光子经过偏振仪而形成偏振荧光荧光偏振免疫测定技术就是利用荧光的偏振强度与荧光分子的大小呈正比的关系建立的免疫分析技术荧光偏振免疫测定技术的原理是：荧光素标记的小分子抗原及待测的小分子抗原与相应的定量抗体竞争结合若待测的小分子抗原浓度高，则经过竞争反应，大部分抗体与其结合，而荧光素标记的小分子抗原多呈游离状态，由于其分子小，液相中的转动速度较快，因此测量到的荧光偏振强度较低反之，若待测的小分子抗原浓度低，抗体与大部分荧光素标记的小分子抗原结合，而形成大分子的标记抗原—抗体复合物，此时荧光偏振强度较高，也就是说，待测小分子抗原浓度与荧光偏振强度呈反比，其浓度可通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立的标准曲线测得因此， FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法F PIA方法操作简便，使用的荧光标记试剂稳定.有效期长，测定结果准确，但其通常不适宜大分子物质的测定其灵敏度与非均相荧光免疫分析方法相比稍低一些，可将相对大量标本进行预处理，去除干扰成分，以提高FPIA灵敏度第 6 页 共 6 页。