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浅谈植物内生菌研究进展陈龙,梁子宁：朱华（广西中医药大学，广西南宁530001）摘要：植物内生菌是指生活史中某一阶段生活在植物组织内，对植物没有明显 病害症状的一类微生物，研究发现其主要包括内生细菌、内生真菌、内生放线 菌内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性物质，从而拓宽了药用资源 并H具有巨大的应用价值笔者对植物内牛菌的发展现状，与宿主植物的关系, 研究方法，研究领域进行了综述，并讨论了内生菌研究未来需要加强和完善的 方面关键词：植物内牛菌；与宿主植物关系；活性物质；研究方法和领域植物内生菌是指生活史中某一阶段生活在植物组织内，对植物没有明显病害症状的 一类微生物，研究发现其主要包括内生细菌、内生真菌、内生放线菌⑴植物内生菌早 在100多年前就被人类在健康植物组织内部发现，由于其对宿主植物没有明显的感染症 状且用肉眼观察不到，所以其作用一直被人们忽视直至20卅纪30年代发现造成畜牧 业重大损失的畜牧中毒是由食用感染内生菌的牧草造成的，内生菌的研究才得以广泛的 开展起來J1993年stierle报道了从短叶红豆杉（TaxusbFevifolia N\M.）中能分离出 一种能产生紫杉醇的内生菌丁。

至此人们经过研究认为，植物内生菌和其宿主之间存在 着相互依存，互忠的关系目前，人们已经渐渐的从植物内生菌中寻找到与宿主相似的 天然化合物，这不仅拓宽了药用植物资源，同样也促进了对稀有珍贵物种的持续发展和 保护除此之外，对植物内生菌的次生代谢的研究也悄然展开近儿年，有研究表明从基金来源：1.广西地道药材两面针内生真菌药用活性物质化学成分筛选（合同编号：丫CSZ2014171）；2.广西道地药材两面针原植物的内生真菌及其药用活性代谢物的抗肿瘤作用研究（合同编号： 2012GXNSFAA053119）；作者简介：陈龙（1988-）,男，广西中医药大学2012级生药学专业硕士研究生，主要从事中药资源开发与利用 通讯作者：梁子宁（1975—），女，副教授，硕士研究生导师，主要从事药用植物资源评价与开发利用 植物内生菌中分离出的次生代谢产物也存在着抗菌活性工「当前，植物内生菌的研究已经成为植物学，植物保护学，农药学，药用植物学和中药资源学等学科领域的研究热点, 其在农业，林业及医药领域具有重要的研究开发价值本文就近10年來，植物内生菌 及其代谢产物的相关研究，做如下简要综述1. 植物内生菌的分布规律及其生长特点植物内生菌普遍存在于植物的根茎叶花果实等器官和组织细胞中，并且广泛地存在 于藻类，苔鉢，蕨类植物，裸子植物和被子植物中。

目前，植物内生菌的研究主要集中 在裸子植物和被子植物这两类植物内生菌的分布规律取决于宿主本身以及内生菌的种 类，在宿主不同器官的分布存在着差异〔5切研究表明，植物内牛菌的分布和牛长特点 还受植物的种类，地理位置，生长环境，气候条件等因素的影响因此内生菌也具有丰 富的生物多样性植物内生菌的种类繁多但主要包括真菌，细菌和放线菌这三类其中 内牛真菌是当前内牛菌研究的热点常燕等血在夹竹桃内主菌杀虫活性研究中，从根茎 叶中共同分离出口6株内生菌，其中内生细菌51株，内生真菌65株张华姣M在对雷 公藤的研究中，分离岀内生菌183株，其中真菌IX株，放线菌23株，细菌49株并 且在雷公藤的不同组织部位的内生菌数量有较大的差异，其中从雷公藤根中分离得到的 内生菌最多89株，叶次之72株，茎分离出的最少22株2. 内生菌与宿主之间的关系对于内生菌的起源，目前存在着内生与外生两种假说前者认为内生菌与宿主之间 可能存在着和同或相似的遗传基因后者认为内生菌可能通过多种途径（以内生菌或抱 子形式通过变形，吸器，渗透）从宿主体外进入宿主由于学术界仍然有分歧和争论尚 须进一步研究，所以在此不作详细讨论内生菌和宿主在长期共处中形成了一种复杂的, 特殊的关系。

它们有的是互利共主的关系，有的是无害或危害寄生的关系〔⑵这两种关 系会因自身，环境，气候等因素的变化而相互转化同时，不同的内生菌对宿主的专一 性也有很大差别有的只与一种植物共生，有的可以和多种植物共生2.1内生菌对宿主的影响2.1.1促进宿主生长根据许多研究表明，感染内牛菌的植物一般都比未感染植物牛长快速的特点内牛 菌可促进植物的生长发育，增加植物的总生物量，单株花序数量和种子数量，提高植物 种子的饱满率和发芽率，促进幼苗存活和分藥生长等〔3内生菌的这种促进植物生长作 用可以从两方面來理解一方面，许多内生真菌可以产生生长素，赤霉素和细胞激动素 等植物牛长激素；另一方面，内生菌能够增加植物的固氮能力和对钾，钙，磷等一些营 养元素的吸收「⑷张集慧等我从天麻，石斛等兰科药用植物中分离出5种内生真菌， 其真菌的发酵液和菌丝体中分提取出5种植物激素，如玉米素，口弓卩朵乙酸，脱落酸，赤 霉素，玉米核昔等，他们都兰花的生长发育具有良好的促进作用戴传超等〔曲从大戟中 分离到内生菌镰刀^{Fusarium sp.)和镰刀 ^Fusarium sp.),在实验中表现出良好的促 进生长效应吕泽勋等“对用绿色荧光蛋白基因标记产酸克雷伯氏菌SG-11研究其对 水稻苗期根部的定殖的研究中发现，产酸克雷伯氏菌(Klebesiellci oxytoca)也能产生生 长素，该生长素对水稻植株的生长发育起着重要调节作用。

除此之外，人们还发现假单 胞菌属、芽抱杆菌属等都能产生分泌呵味乙酸或赤霉素，草生欧文氏菌(Erwinia herbiocla) 不仅能产牛眄I喙乙酸，而且还能产牛细胞分裂素2.1.2促进宿主次生代谢产物的产生内牛菌能够促进宿主植物次牛代谢产物的产牛，可能主要由以下两种原因一，由 于基因的重组或因长期共存而产生信息交流致使内生菌产生了与宿主相同的信息传导 同路，从而使内生菌合成了与宿主相同或相似的次生代谢产物如Stierle等人从短叶红 豆杉树皮中分离的内生菌也能分离出短叶红豆杉植物自身代谢产物一紫杉醇二、内生 菌参与宿主次生代谢物的合成，从中协同或催化宿主植物产生次生代谢产物所需要而宿 主植物体内又不能独立合成或无法合成的酶或蛋白质，从而影响宿主植物产牛次牛代谢 产物的过程张薇从人参根部分离得到2株对人参皂昔Rbl具有专一转化活性的内生 菌，莫勒接酶(Zygorhynchus Fnoelleri)和灰绿犁头酶[Absidia glauca),其能够将皂背Rbl 转化为人参皂昔Rd2.1.3增强宿主抗逆性内牛菌能够增强宿主植物的抗逆性，主要表现在抗旱，耐热，抗病虫害和对病原体 拈抗等方面。

研究表明，感染内生菌的植物比未感染的植物在应激环境中是我适应性是 明显增强许多资料证明内生菌与植物的共生协助了早期植物在一些恶劣，贫瘠的土壤 上生存当植物感染内生菌后，其某方面的抗逆性明显增强，从而提高了该植物在逆境 环境中存活的几率：，，J9，?0]o如杜永吉等对植物高羊茅的内生真菌Neotyphodium.ty- phinum研究发现，感染该内生菌的植株利用水分效率源高于未感染的植株，同时前者叶 片的相对含水量高于后者，具有更强的抗旱保水能力2.1.4对宿主的毒性作用或抑制作用内生菌虽然能够产生促进植物宿主成长的植物激素，但同样也会产生一些对宿主不 利的物质如BARBARA S和CHRISTINE『幻在内生菌和宿主共同培养的体外实验中发 现，在这种环境中有利于内生菌生长而宿主植物则更容易坏死，进而不利于宿主植物生 长此外也有一些研究表明，内牛菌还可以通过产生很多对宿主有毒性作用的胞外酶， 而使宿主产生坏死2.2宿主对内生菌的影响内生菌生活在植物组织内，对植物没有明显病害症状这种能够维持内生菌在宿主 体内无害或微害的寄生关系的原因主要是因为宿主对内生菌的抵抗反应与此同时，有 研究报道，内生菌对宿主有优势选择性。

2.2.1宿主植物对内生菌的抵抗反应宿主对内生菌和致病菌在结构上的相似性，都可以被宿主植物无差别的认知，当内 生菌感染宿主后，将诱导宿主产生慢速或快速的抵抗反应虽然这些机械的抵抗反应没 能观察到，但Cabral通过实验发现，宿主在感染内牛菌的位点附近有明显的乳状头的 产生Narisawa发现感染的宿主根部有细胞壁的变厚现象，在宿主对快速反应时能检测 到有过氧化氢等生化物质的产生型宿主对内生菌的这种抵抗反应可看作是宿主的自 我保护，但宿主内环境的改变也对内生菌的生存形成压力，为了克服这种压力，研究发 现许多内牛菌在植物体内定殖时，往往会表现出全体聚集牛长行为，相互黏附在一起， 形成包括集团，微菌落，共质体等在内的生物薄膜，并以此形式与宿主进行交互作用 [25, 26]O另外，内牛菌为了避免或者克服这种不明确的抵抗反应，必须重组自身以适应宿主 细胞而维护自身的完整性以求得共存2.2.2内生菌对植物宿主的优势选择虽然植物和内生菌在生长期的共存生长中不表现出明显的病害症状，但对于植物来 说，内生菌毕竟是一个“入侵者”植物对内生菌其实是存在着对抗的对于内生菌来 说，植物体的内环境是它赖以生存的外界环境。

不同的宿主植物对内生菌的影响是不同方的即便是同科同属中该植物的一个变种，所以内生菌会选择那些利于自己的生长的 植物宿主生长在芬兰东南部具有不同生态环境岛屿上的白桦两个品种欧洲桦 Betulapubescens Ehrhart和垂枝桦B.pendula Roth,其内牛菌种群结构存在较大差异，即使 同一种内生菌定殖率也不同内生菌毛日规壳菌Gnomonia setacea （per.:Fr.）Ces.& deNot. 在前者定殖率达到25%,而后者叶片只有3%o这种差异可能是由于垂枝桦存在形态学 和化学上的障碍，抑制了毛日规壳菌对其叶片的侵染「以「少 7*| 王梅霞’研究发现西安的杜仲Eucommia ulmoides叶片中以交链泡霉Alternaria sp. 和刺抱売霉Chaetomella sp.为优势类群,而南京各地杜仲叶片主要以蜜抱酶Sphacelia sp. 和刺范壳霉Chaetomella sp.为优势类群，在不同地区杜仲的枝条和树皮组织中优势种群 也存在差异3. 研究内生菌常用的方法根据大量文献，总结出如下研究方法3.1分离纯化及保藏内生菌分离常采用组织块法「嗽在宿主细胞不同组织器官如：根、茎、叶、花、果 实等取若干克或小块（根据具体实验而定）。

按如下程序进行消毒：用清水清洗表面一 消毒纸巾吸干表而的水分一75%或90%酒精漂洗15~20s-无菌水冲洗3〜4次一消毒纸 巾吸干表面的水分-0.1%升汞漂洗3〜5min （根据所取部位适当加减时间）一无菌水冲洗 4〜5次无菌条件下将处理后的植物组织（枝条、根的韧皮部或叶子等）切成适当大小 的小方块将其放在PDA或其他培养基上，28C,培养3〜7天待组织块段面边缘有 菌丝长出后，挑去前端菌丝转入另一 PDA平板培养基，经纯化，得到单一菌落后，斜面 保存备用实验的方法步骤可根据实验要求进行调整3.2菌株鉴定肉眼观察菌落表而形态、大小、颜色、质地、生长、速度、边缘形态并结合光学显 微镜观察抱子形态、产抱结构、菌丝颜色及有无横隔等微观特征一般实验对内生菌常 会采用三种方法来综和鉴定即点植培养法、载片培养法、抨片法内牛菌的鉴定常参 考《真菌鉴定手册》对于内生菌和内生放线菌的初步鉴定常采用，菌落的形态特征， 革兰氏染色发，荚膜染色法，穿刺培养法和芽抱染色法内生细菌的鉴定常参考《常见细菌鉴定于册》3.3具有活性菌株的筛选及培养在内生菌活性的测定中，内生真菌常用对峙培养法而细菌放线菌的活性测定常采 用混浇平板法。

在一定条件下按选定的培养法的要求培养数口，根据菌落的生长速度、 菌落之间有无抑菌带、菌落前缘菌丝是否发牛稀疏和萎缩畸变等现彖，判断测定菌株活 性。