免疫沉淀试验.ppt

第六章 免疫沉淀试验,教 学 目 的,掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原理 熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、沉淀反应的应用,一、基本原理 免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象第一节 免疫沉淀试验的基本原理,形成肉眼可见的大的免疫复合物第一阶段,第二阶段,沉淀反应分两个阶段,抗原抗体特异性结合，快速但不可见,环状沉淀试验絮状沉淀试验 免疫浊度测定,免疫扩散试验 免疫电泳技术,液体内 沉淀试验,凝胶内 沉淀试验,,二、免疫沉淀试验的分类,,,1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价,三、 免疫沉淀试验的特点,第二节 液体免疫沉淀试验,一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物第二节 液体免疫沉淀试验,抗原稀释法：抗原最适比例,抗体稀释法：抗体最适比例,方阵滴定法：抗原抗体最适比例,一、絮状免疫沉淀试验,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,,加入抗血清,各管抗体量不变,,振摇 混匀、37℃孵育,沉淀量不同,出现沉淀量最多的管为最适比例管。

轻摇,絮,状,沉,示,意,图,淀,,,,Ag,Ab Ag,最适比方阵测定法,,原理： 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在增浊剂中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度二、免疫浊度测定,优 点：,稳定性好、简便快速，易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染,1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法,分 类：,透射比浊试验和散射比浊试验光路,检测器A,检测器B,IC,,,,,I0,Iθ,I,,θ,透射比浊试验,散射比浊试验,,,当复合物＜3×106dal， I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力强，并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂,补充：免疫浊度测定影响因素,（1）抗原抗体的比例,在抗体过量的反应体系中,抗原量的递增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个抛物曲线。

海德堡曲线,（2）抗体的质量,抗体的特异性 抗体的效价(1:20) 抗体的亲和力 R型和H型抗体（R型）,（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为：6.5-8.5 离子强度大，IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20,,1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂抗体成分 2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3.样品本身的浊度处理不当 4.试剂污染变质 5.比色杯不够清洁,伪浊度形成的原因,第三节 凝胶内免疫沉淀试验,第三节 凝胶内免疫沉淀试验,可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环原 理,反应介质：凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶中,原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环环的大小与抗原的浓度成正相关技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线,定量试验,一、单向免疫扩散试验,,,倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环,一、单向免疫扩散试验,,T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线,t1为16-24h；t2为24-48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线,Mancini曲线,Fahey曲线,待检蛋白质抗原须具备的条件,仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25g/ml以上,单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清,一、单向免疫扩散试验,应 用,IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白 等多种血浆蛋白的检测,技术要点： 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散,二、双向免疫扩散试验,,1.判断抗原或抗体的存在 以及估计相对含量,2.分析抗原或抗体相对分子量,,二、双向免疫扩散试验,3.分析抗原的性质,,二、双向免疫扩散试验,,4.滴定抗体的效价,5.鉴定抗原或抗体纯度,,二、双向免疫扩散试验,应 用 1.AFP检测的最早方法 2.血清中含量较高的酶类、细菌病毒感染后血清中产生的抗体的检测,三、免疫电泳技术,优点： 1.加快反应的速度。

2.提高了灵敏度 3.增加了分辨率电泳分析,＋,沉淀反应,抗原抗体反应 的高度特异性,电泳技术的高 分辨率、快速、 微量,,,,三、免疫电泳技术,电泳（electrophoresis） ：在外加电场的作用下带电颗粒向着其电性相反的电极移动，称为电泳电泳迁移率： 定义：同一电场条件下，各种带电粒子在 单位时间内移动的距离M=cm2/VS 影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电 渗,,电渗： 电场中液体相对于固体的运动 ①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压,电渗方向与样品运动方向一致： 样品迁移率加快 电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退,电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶 常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝固，色泽透明、质地均匀、富有弹性蛋白质的两性解离性质： --NH2 + H2O --NH3+ + OH- --COOH --COO- +H+ 两性离子 pH=pI 电中性，无电泳移动性 pHpI 碱性溶液 带负离子，向阳极泳动,,,原理：双向扩散+电泳 实质上是定向加速度的免疫双扩散技术 比双向扩散试验灵敏度提高8∼16倍,（一）对流免疫电泳,通电,－,蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动,抗体球蛋白带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动,＋,,,（一）对流免疫电泳,,结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。

沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合一）对流免疫电泳,,技术评价： 1.简便、快速,敏感度较双扩提高8-16倍，可测蛋白质浓度达 ug/ml. 2.要求抗原、抗体比例严格 3.不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测,抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术,（二）火箭免疫电泳,1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度技术要点,（二）火箭免疫电泳,火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本,-,+,（二）火箭免疫电泳示意图,,结果判定： 1、定性：直接观察、染色 2、定量：根据峰高-浓度标准曲线计算 3、为提高灵敏度，可加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰,原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散,（三）免疫电泳,,根据各蛋白所处的电泳位置,可分为: 白蛋白区、球蛋白区、1区、2区、区、区 + -- ALB 1 2   白蛋白 抗胰蛋白酶 触珠蛋白 转铁蛋白 IgG 前白蛋白 酸糖蛋白 铜蓝蛋白 C3aC3b CRP 1脂蛋白 抗糜蛋白酶 巨球蛋白,,,,,,,,,,,,1.纯化抗原和抗体成分的分析 2.正常及异常免疫球蛋白的识别与鉴定,应 用,免 疫 电 泳,（三）免疫电泳示意图,,,技术评价： 1.分辨率较高 2.仅定性 3.扩散时间长，影响因素多，结果较难分析 4.目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别与鉴定。

抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型,原理,区带电泳 ＋ 沉淀反应,（四）免疫固定电泳,,,,,左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常,,,,,（四）免疫固定电泳示意图,,原理： 待检蛋白电泳 固定剂及各类抗血清加于凝胶表面的泳道 抗原与对应抗体反应 沉淀 漂洗 染色 某一抗原的存在?,,,,,,,分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析应用,最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型优点,（四）免 疫 固 定 电 泳,,应用:M 蛋白的鉴定和分型,,（五）交叉免疫电泳 （六）自动化免疫电泳,第四节 免疫沉淀试验的临床应用 免疫浊度法：蛋白质的检测 如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、C反应蛋白等,第五节 临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点 一、胶乳增强的透射免疫比浊试验在全自动生化分析仪中的应用 二、胶乳增强的透射免疫比浊试验在血凝固分析仪中的应用 三、免疫固定电泳在半自动电泳仪中的应用 四、散射免疫比浊试验在特种蛋白免疫分析仪中的应用,第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素 如温度、电解质、酸碱度等,名词: 沉淀反应 简答: 1.双向免疫扩散试验的应用 2.免疫电泳技术的类型,思 考 题,。