两种高效液相色谱系统灵敏检测血浆中双酚A的方法.doc

两种高效液相色谱系统灵敏检测血浆中双酚A的方法摘要：这篇文章的目的是建立一种简单准确检测血清、尿液等体液中双酚A 的方法两种高效液相色谱系统（HPLC），11PLC联合电化学检测器（ED）和IIPLC 联合质谱检测，使用电喷雾离子源（ESI）作为连接，共同检测固相萃取血清 中BPA的样品水或者50%浓度以下的乙醇可有效地萃取血清中的BPAHPLC-ED 的检测限为0.2ng/ml, HPLC-MS的检测限为0. lng/ml两个11PLC系统所得到 的数据具有很好的相关性正常人类的血清中BPA的浓度较低（0-1.6ng/ml） 在牛的胚胎血清和羊的血液中均发现相当浓度的BPA但是在刚刚采集到的新 鲜羊血中并没宥发现BPA我们认为血液在采集盾准备阶段的操作过程中产生 了 BPA在用PC离心管做实验吋发现聚碳酸酯瓶的BPA浸入血液中的量是浸 入水中的40倍，且浸入量与温度冇关（37C〉20C>5C）关键词：双酚A1. 介绍：CJ从1993年，Krishman等证明聚碳酸酯瓶在高温灭菌的过程中会产生双 酚A,并且会刺激人体产生雌激素以来BPA对人体健康是否会产生影响就一 直是一个有争论的话题。

据报道树脂底物和牙科用密封剂会产生大量的BPA, 已经宥许多研究指出BPA存在于CJ然环境、婴儿奶瓶、塑料废弃物的水体中 由于缺乏合适的检测生物样品中BPA浓度的方法，现在还不知道多大浓度的 BPA会对人体健康造成危害目前，气象色谱质谱（GC-MS）和高效液相色谱- 紫外荧光法通常用于检测水样中的BPA,而11PLC-MS也已经广泛用于生物样品 中BPA的分析此外，电喷雾离子源用来连接质谱可以将不稳定的化学成分 如蛋白质、多肽、核酸以及二十烷类去晶体化和离子化Youkubo提出直接用 HPLC-MS分析检测水样中的BPAo他认为在三种离子化方法（ESI、EI和APCI） 中ESI的灵敏性最好另一方而，电化学检测器（ED）现在也广泛用于分析具 有较高特异性的酚类化合物因此我们确定了一种便捷、准确检测BPA的方法， 即使用两种HPLC系统，一个与ED连接，一个使用ESI-MS在这次试验中， 我们将分析不同实验材料中BPA的含量2. 实验部分2. 1材料从日本制药公司购买牛胚胎血清和羊的血浆从WAKO化学公司购得BPA 聚碳酸脂离心管从Nalgerwnc W际公句获得干燥冷冻的商用血清蛋白从H本 畜牧产业公司获得，蛋白在水中的溶解浓度为5g/l。

新鲜的羊血是从三只家 养羊的腿部血管中收集到的人体的血液来自21名(9女，12男)健康的闩 本成年志愿者，年龄分布在30-50之间100g人体血红细胞经过十分钟离心 分离出血将、血清为避免受到BPA污染，玻璃注射器和试管在使用_前都要经 过99%乙醇清洗试验中BPA的水溶液有ODS-silica>scp-pak制备Oasis HLB 用来固相萃取BPA,使用3.5ml中醇和3.5ml水进行冲洗使用乙酸乙酯作为 洗脱液每次试验前都要做BPA的空白检测确保没宥BPA污染2.2从血浆和血清中提取BPA0. 2-0. 5ml血浆或血清用超纯水稀释到5ml样品适用于Sep-pak，用3. 5ml 的乙醇分离溶液中的极性脂类，用3.5ml石油醚分离溶液中的非极性脂类最 后，用3.5ml乙酸乙酯萃取BPA萃取液用氮气吹干残留物溶解在乙腈-水 (40:60)的溶液中BPA标准曲线用lug/ml原料溶于25%甲醇中制成2. 3实验时从PC管中提取血浆中的BPA和水2ml不含BPA的新鲜羊血浆分别保存在3个PC离心管中，他们各自的保 准温度为37C、20C、5C每天从各个管中提取0.2ml用于BPA的检测，为 防止BPA污染，在操作过程中只是用超纯水。

2.4高效液相色谱和质谱的操作条件其中一个HPLC系统的型号为LC-10 AD,使用VP-ODS色谱柱(150mmX 4.6mm)和电化学检测器(Conlochen II 5200A )流动相使用乙腈-水-磷酸 (40:60:0. 2)流速为l.Oml/min,色谱柱温度为4(TC注入的样品量为50ul ED使用条件：保护细胞电势E 600mV,分析细胞电势E： 300mV,和E2 550mV;电 流均为luAo鉴定BPA耍使用色谱分析法将11PLC中BPA的出峰时间与标准曲 线的吋间进行比较对于一个完整的分析，BPA的峰值保留吋间要由GC-MS确 认另一个HPLC系统是Alliana2690型,同时要使用3. 5um C18萃取柱和ZMD 喷雾质I普仪，联合ESI电喷雾接口流动相是乙腈-水(40:60)流速和色谱 柱温度分别为0.25ml/min和40CESI阴离子扫描条件:毛细管电压3. 5KV; 岡锥电压39V;分析电压59V;反溶剂温度390C注入样品量20ul3. 结果试验中，在BPA的洗涤和分析过程中没宥发现污染用50%的乙醇和水分 别提取血浆和血淸中的BPA表现吋出的提取能力相同。

然而当乙醇的浓度大于 50%吋，提取的能力减弱了在HPLC-ED的系统中，检测下限为0.2ng/ml当 往水中加入10ng/ml的BPA时，HPLC-ED在0、1、2、5天的检测值分别为9. 6、 9. 7、9. 3和9. 8ng/ml,表现出无规律的变化HPLC-ED中BPA的峰值有GC-MS 确定在HPLC-ED分析BPA吋，没有其他类似结构的化合物，如176-雌二醇、 17(i -乙炔雌二醇的干扰在HPLC-MS的监测范围为0. lng/ml两种检测系统 的线性数据范围为0-100ng/ml加入10ng/ml的BPA到人的血浆和羊的血清 中，提取能力为93%阁1表示在商用纤维蛋白血浆和人类血浆中检测BPA标准曲线的峰值 用11PLC检测纤维蛋白血浆和人体血浆中BPA所得到的质谱峰值与真实的数据 一致样品的出峰吋间可以用来鉴定是否是BPA利用两个系统检测同一样品 中的BPA所得到的数据具冇很好的相关性在人的血浆中BPA检测的平均值和 标准偏差为男性0. 590. 21ng/ml,女性0. 330. 54ng/m.迅速检测刚刚采集 到的新鲜羊血，其中并没有发现BPA用乙醇处理后的玻璃容器对血样的污染 可以忽略不计。

使用两种HPLC系统检测商用纤维蛋白血浆、羊血清和牛备胎 血清中的BPA浓度，其数据如表1所示HPLC-MS的检测值比HPLC-ED的稍高 一些在用塑料瓶保存的血清中，AD检测到较高浓度的BPA同吋，塑料瓶保 存的冷冻干燥的牛血清蛋白中也发现大量的BPAoPC离心管离心制出的羊血浆 中BPA含量随环境温度和离心时间的增加而增多在所宥温度下PC管中羊血 浆的BPA含量都要比同条件下水中含量多特别是实验第八天，37"C下羊血浆 中BPA浓度为333. 5ng/ml比水中的浓度高出44. 5倍在20C和37C下羊血 浆中的BPA浓度比5C卜*的高出3.9倍和12.4倍，相似的现象还可在人体血 浆中发现37C下人类血浆中BPA在第四天的浓度为112.28ng/ml，第八天 为 369. 753. Ong/mloBPA在羊血清中的析出速度取决于溫度，尤其是在人体体温的范围内BPA 的释放速度得到明显加强最近发现一种用于牙科材料的新型松香成分，其在 人体温度十* BPA的释放速度较大所以BPA从牙科和外科医疗材料中的迁移机 理宥必要作进一步的研究4. 讨论使用Scp-pak和Oasis装置可以很方便地从血浆、血清等生物样品中提取 BPA。

两种装置的结果没有什么明显的区别两种HPLC系统在操作方便程度和 准确性方面都很适合分析水相生物样品人们认为因为BPA宥很好的水溶性，可以从牙科材料和医用密封剂中溶出 用塑料瓶保存的商用血浆中含有较高浓度的BPA,而在用玻璃瓶保存的商用血 浆中也发现了惊人浓度BPA.我们怀疑商用血浆在采集的后续操作中受到高浓 度BPA的污染，例如在血浆作脱纤维蛋白的过程中受到污染这也可以解释为 什么在家养羊的新鲜血液中没宥发现BPA,以及已相当量的BPA在5C的PC 瓶中被发现，其浓度是37C水中的40倍这些结果表明BPA在人体体液如血 清、唾液中冇很好的溶解性同时，体液中BPA的含景也冇酶反应决定在实 验中，将人体血清和水同时在60C K保存3天，其BPA的增加量比37"C条件 下高出许多结果表明BPA的产生速率与温度和体液中的脂类等成分有很大关 系最近冇报道称低浓度的BPA可以扰乱幼鼠的生殖系统，刺激脑垂体释放催 乳素由于商用血清在许多实验室中用于疫苗的生产和细胞培养，这些血清是 否会产生副作用还有待于进一步观察5. 结果我们总结了两种带有固相萃取装置的HPLC系统可有效监测生物样本中低 浓度BPA的方法。

两种系统优缺点各不相同HPLC-ED易于操作，并且维持费 用较低，但是不能定性确定样本中BPA而11PLC-MS可确定BPA的存在，但是 维持费用很高所以在一个完整的鉴定过程中应该两种系统一起使用参考文献11J A.V. Krishnan, P. Stathis, S.F. Permuth, L. Tokes, D. Feldman, Endocrinology 132 (1993) 2279.[2] N. Olea, R. Pulgar, P. Perez, F. Olea-Serrano, A. Rivas, A. Novillo-Fertrell，V. Pedraza, A.M. Soto, C. Sonnenschein, Environ. Health Perspect. 104 (1996) 298.[3] W. Spahl, H. Budzikiewicz, W. Geurtsen, J. Dent. 26 (1998)137.[4] W. Geurtsen, Eur. J. Oral. Sci. 106 (1998) 687.[5J C.A. Staples, P.B. Dom, G.M. Klecka, S.T. O’Block，L.R.Harris, Chemosphere 36 (1998) 2149.[6J A. Gonzalez-Casado, N. Navas, M. del Olmo, J.L. Vilchez, J.Chromatogr. Sci. 36 (1998) 565.[7] K.A. Mountfort, J. Kelly, S.M. Jickells, L. Castle, Food Addit. Contam. 14 (1997) 737.[8] T. Yamamoto, A. Yasuhara，Chemosphere 38 (1998) 2569.[9] M. Yamashita, J.B. Fenn, J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.[101 J.F. Banks, J. Chromatogr. A. 691 (1995) 325.[11] J. Sajiki，H. Kakimi, J. Chromatogr A. 795 (1998) 227.[12J J. Yonekubo, S. Sasaki, M. Ichiki，H. Sasaki, BUNSEKI KAGAKU 48 (1999) 571，Japanese with English abstract.[13] M.E. Murphy，J.P. Kehrer, J. Chromatogr. 421 (1987) 71.[14] G. Achilli, G.P. Cellerino, G. Melzi d’Eril，S. Bird, J. Chromatog。