第十四章 分子发光分析.ppt

第十四章 分子发光分析（Molecular Luminescence Analysis）本章主要内容：一、 分子荧光及磷光分析 1. 基本原理：分子能级、荧光及磷光的产生；定性分析；影响荧光及荧强度的因素；定量分析 2. 荧光仪器 3. 磷光分析：磷光的特点；低温荧光；室温荧光；磷光仪器二、化学发光法：基本原理、反应类型、仪器,一、 分子荧光分析及磷光分析（一）基本原理 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等1. 荧光和磷光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级P228） 在单重激发态中，两个电子平行自旋，其激发态的平均寿命大约为10-8s三重态分子激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。

禁阻跃迁,各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关图 8-1,设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第一单重态S1及第二单重态S2P229及P230图8-2）a. 振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫也就是 在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出发生振动弛豫的时间为10-12s数量级荧光、磷光 能级图 → 振动弛豫,b. 内转移（Internal Conversion，IC） 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，时间也为10-12s数量级右图中指出，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级荧光、磷光 能级图,c. 荧光发射 处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。

注意：基态中也有振动驰豫跃迁很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3为的荧光荧光的产生在10-7-10-9s内完成荧光、磷光 能级图,d. 系间跨越（Intersystem Conversion，ISC） 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间跨越通常，发生系间跨越时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光这是产生延迟荧光的机理荧光、磷光 能级图,e. 磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间跨越方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-4-10s因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间荧光、磷光 能级图,荧光与磷光的根本区别： 荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的； 磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。

f. 外转移（External Conversion，EC） 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失这一现象称为“熄灭”或“猝灭”书P230图8-2,2. 激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，绘制激发光谱曲线书P230图8-3第一部分） 注意：激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光 如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线 （书P230图8-3第二部分）,在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。

从图8-2亦可看出） 荧光发射光谱的基本特性：（1）Stokes位移 （P233） 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失因此，在激发和发射之间产生了能量损失2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带由于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关3）镜像规则（P233图8-8，8-9） 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层形成的其形状决定于第一电子激发态中各 振动能层的分布情况 荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能层回到基态中各不同能层形成的。

所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况 基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似图8-8 蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）图（书P233）,3. 荧光和分子结构的关系分子产生荧光必须具备两个条件（P234~235） ① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构（通常为苯环或稠环的刚性结构，书P234举例），才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率1) 量子产率 荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示： （P234公式8-1） 在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间窜跃和外转移等。

很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关若用数学式来表达这些关系，得到： （P234公式8-2） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和 （a）凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明kI很小，可以忽略不计一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关 （ b）磷光的量子产率与此类似2) 荧光与有机化合物的结构（P235） a. 跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历或n激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。

在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率）这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n大100-1000倍），其次，跃迁的寿命约为10-7—10-9s，比n跃迁的寿命10-5—10-7s要短 此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小（S1T!能级差较大），这也有利于荧光的发射，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型b. 共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大 例如，在多烯结构中，ph（CH=CH）3 ph和ph（CH=CH）2 ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28 共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生c. 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。

因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性荧光素与酚酞的荧光活性区别即为此）,d. 取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响 给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使荧光增强因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大 吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光 取代基的空间障碍对荧光也有影响 立体异构现象对荧光强度有显著的影响4. 溶液的荧光（或磷光）强度(1) 荧光强度与溶液浓度的关系（P236-237，定量依据与方法） 荧光强度If正比于吸收的光强Ia与荧光量子产率 If = ×Ia 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律 Ia = I0 - It = I0(1- e - l C) I0和It分别是入射光强度和透射光强度。

代入上式得 If =  I0(1-10 - l c) =  I0(1- e -2.3 l c),。