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EPSP合酶的研究进展EPSP合酶的研究进展 2014/07/21 《生物技术通报杂志》2014年第七期1莽草酸途径简介莽草酸途径是存在于植物、细菌和真菌中的一条重要代谢途径，而动物体内的代谢中是不存在此途径的，此途径使糖代谢和次生代谢紧密地联系在一起该途径有7个酶参与催化反应，并且这7个酶都可以通过真核和原核细胞来源的基因表达获得第一步反应是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4磷酸（E4P）的反应PEP和E4P分别是由糖酵解途径和戊糖磷酸途径产生的物质最后一步反应是分支酸的生成分支酸不仅是莽草酸途径的终产物，也是3种芳香族氨基酸和一些次生代谢产物的主要前体分支酸的去向如图1所示植物的次生代谢产物合成途径包括苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径等研究表明，许多次生代谢产物的芳香族氨基酸前体都是来自莽草酸途径产生的芳香族氨基酸及其中间产物，因此莽草酸途径在合成有商业价值的天然产物过程中起着非常重要的作用莽草酸途径在植物中的重要性也得到证实，由莽草酸途径产生的物质大约占植物干重的35%以上。

由于莽草酸途径在哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和昆虫中是不存在的，近年来它逐渐成为抗菌素、除草剂和活体疫苗的靶标例如，由恶性疟原虫引起的疟疾，每年大约200多万人死于这种疾病，科学家利用莽草酸途经寻找新型的抗疟疾药，目前草甘膦作为疟疾的疗效药已经在小鼠身上成功试验2EPSP合酶的分类、细胞中定位及不同组织中的分布目前EPSP合酶被分为两种类型，类型I包括来源于大肠杆菌（Escherichiacoli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的EPSP合酶；类型II包括来源于覆盆子土壤杆菌（Agrobacteriumtumefacienssp.CP4）、无色杆菌（Achromobactersp.LBAA）、假单胞菌（Pseudomonassp.PG2982）等类型II的EPSP合成酶多克隆抗体与类型I的EPSP合酶不会发生抗原抗体交叉反应，而且两种类型序列一致性30%左右I型EPSP合酶对除草剂草甘膦敏感II型EPSP合酶在草甘膦存在时，相对于I型EPSP合酶表现出更高的催化效率研究人员将II型EPSP合酶转入作物中可以对除草剂产生抗性，显著有效的控制了田间杂草目前已知的II型EPSP合酶都是在微生物中存在的。

在今天市场上销售的大多数耐草甘膦产品都含有农杆菌CP4-EPSPSDella-Cioppa等发现在植物细胞中，前体EPSP合酶存在于细胞核中，但是当该酶变为成熟的EPSP合酶（Matureenzyme）时，是存在于叶绿体内EPSP合酶是通过前体EPSP合酶合成的绝大多数植物的EPSP合酶的活性中心存在于叶绿体中前体EPSP合成酶也具有催化活性，并且它的催化活性也受到草甘膦的抑制前体EPSP合酶的N端为信号肽所在的位置信号肽的主要作用是引导EPSP合酶进入叶绿体基质，之后信号肽被水解，前体蛋白就变成成熟的EPSP合酶例如，童旭宏等发现陆地棉EPSP合酶基因编码521个氨基酸残基，前74个氨基酸残基为运输肽，当前体EPSP合酶进入叶绿体后经加工剪切信号肽，变成成熟EPSP合酶成熟EPSP合酶包含447个氨基酸，比前体EPSP合酶氨基酸少了74个氨基酸，分子量约为48kD信号肽对于EPSP合酶定位于叶绿体起着决定性的作用微生物的EPSP合酶存在于细胞质中，并且没有一段氨基酸序列在N端，所以微生物EPSP合酶无信号肽我们通过转基因技术把微生物的EPSP合酶基因导入植物中虽然能够成功表达EPSP合酶，但是不能进入叶绿体，如果加上信号肽序列，就能把表达的EPSP合酶定位到叶绿体上。

植物中的EPSP合酶主要存在叶片、根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中，叶片中合成大量的芳香族氨基酸，而在根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中既能够自身合成，也能吸收叶片中的芳香族氨基酸3EPSP合酶的三维结构与活性区Krekel等成功纯化出大肠杆菌的EPSP合酶通过对此酶核磁共振及晶体衍射研究分析发现，其合酶由两个结构域组成，每个结构域包含3个相同的βαβαββ折叠单位，每个折叠单位由两个平行的α螺旋和4个β折叠组成（图2）研究人员发现大肠杆菌EPSP合酶共有427个氨基酸残基，PEP结合位点与Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411这6个氨基酸残基有关，Arg-27与莽草酸-3-磷酸（S3P）结合位点有关EPSP合酶蛋白的N端和C端都在同一个结构域中，PEP主要与EPSP合酶的C端结构域结合，而S3P与EPSP合酶主要结合在N端结构域［29-31］两个平行的α螺旋在两个结构域间形成了可以吸引负电荷基团的正电荷区EPSP合酶存在状态分为两种：一种是开放（Open）状态（图3-a），当没有底物与合酶结合，且两个结构域相距较远时存在的状态；当酶与底物S3P结合时，两个结构域相互靠近，并且在两个结构域之间裂缝中出现酶的活性位点，这时合成酶存在的状态为关闭（Closed）状态（图3-b）。

在关闭状态下，采用限制性胰消化酶也很难使其消化，在开放口的90-102位氨基酸及附近的1区（123-134位氨基酸）、2区（140-152位氨基酸）、3区（355-366位氨基酸）与底物结合，从而避免了这些区域被消化，通过这个试验确定了EPSP合酶的活性区域如果将EPSP合酶与底物结合区域的某些氨基酸残基替代，如将Gly96改为Ala、Pro101改为Ser，则草甘膦就很难与合酶结合，这时该酶表现出耐草甘膦的特性易弋等对盐藻的EPSP合酶三级结构进行预测并对氨基酸序列进行多重比对发现，盐藻EPSP合酶的氨基酸序列与高等植物、细菌一样，都有开放和关闭两种状态，并且都含有3处氨基酸序列非常保守的区域，这些非常保守的区域就是EPSP合酶与酶底物PEP、S3P或草甘膦结合的活性位点，如果改变保守区域中的一个位点，那么酶的活性将会改变，草甘膦的抑制作用也会减弱研究人员发现细菌和植物的EPSP合酶是一个单体酶，分子量大约为44-48kD而真菌的EPSP合酶属于AROM蛋白结构域中的其中一个，AROM蛋白通常是以二聚体形式存在的，单体形式下没有催化活性，分子量比较大，最多含有1618个氨基酸，最少含有1563个氨基酸，而且AROM蛋白是一个同时具有脱氢奎尼酸合酶、脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶和EPSP合酶活性的5功能多肽，催化真菌中芳香族氨基酸合成途径的第3步到第6步的反应。

4EPSP合酶的催化机制EPSP合酶作为莽草酸途径的第6位酶，参与合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）和许多次生代谢产物，如泛醌（Ubinquinone），维生素K（Vitamink），维生素K2类（Menaquinone）等EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基团从PEP转化到S3P上形成产物EPSP，并释放出一分子无机磷，这个化学反应是PEP的C-O键裂解而不是经过P-O键的裂解，并且在PEP上发生乙烯基质子的交换之前有研究者认为合酶与底物的结合是随机的，但是通过用动力学优化的底物诱导试验证实了酶与底物结合是有先后顺序的1988年，Wibbenmeyer等将大肠杆菌EPSP合酶纯化，当纯度达到97%以上时，通过核磁共振（NMR）和快速淬火动力学（Raidquenchkinetics）方法得到了EPSP合酶催化S3P和PEP的反应是一个缩合反应，EPSP合酶和S3P及PEP形成了一个四面体过渡态Ⅰ，并伴随着生成一个EPSP缩酮副产物Ⅱ，过渡态Ⅰ随后生成EPSP并释放一分子无机磷（图4-a）1997年，Studelska等利用固体核磁共振（Solid-stateNMR）方法对EPSP合酶的催化机理重新进行了研究，发现PEP首先和EPSP合酶形成过渡态A、B，之后与S3P结合形成合酶缩酮过渡态C，而后生成EPSP（图4-b），这种催化机理也得到了研究者的证实。

5EPSP合酶基因及表达目前已经从细菌，真菌和植物中分离克隆出许多EPSP合酶基因在原核生物中，许多EPSP合酶基因被克隆与分析1984年，Duncan等［44，47］首次克隆出长度为1284bp，编码427个氨基酸残基的E.coliEPSP合酶基因，并且该基因内没有内含子Comai等对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellavtyphimurium）EPSP合酶基因进行克隆发现，基因编码427个氨基酸，合酶蛋白的分子量约为46kD有研究者对大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合酶基因进行了对比发现，二者的核苷酸序列差异为21%，同义密码子有78%在第1位或第二位碱基上发生变化，65%在第3位碱基上变化，氨基酸序列的同源性为93%，并且两种多肽的15个N端氨基酸残基也是相同的，在86-131位氨基酸之间的区域为高度保守区域，而在302-371和381-422位氨基酸之间的区域为C端高度保守区域脯氨酸分别位于这两种合酶序列中的不同位置，位于鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶序列的85位上，而在大肠杆菌中位于合酶序列的81位上，并且在81-85位的氨基酸残基在鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶序列中是不存在的，两者其它部位的脯氨酸是完全保守的。

在真菌中，许多EPSP合酶基因也被克隆与分析Charles等报道了真菌构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的EPSP合酶基因，其合酶属于AROM蛋白结构域中的其中一个，基因中含有一个单一的阅读框架，长度为5311bp于海涛等克隆分离得到了假丝酵母TY-JM和黄曲霉TZ1985的EPSP合酶蛋白编码序列假丝酵母TY-JM的EPSP合酶编码序列长度为1311bp，编码436个氨基酸，理论分子量为46kD，黄曲霉TZ1985的EPSP合酶编码序列长度为1353bp，编码450个氨基酸，理论分子量为48kD通过与其它物种EPSP合酶氨基酸序列对比分析，TY-JMEPSP合酶基因与杜氏假丝酵母、热带假丝酵母和白假丝酵母等物种的同源性为80%，而与棒曲霉、核盘菌的同源性为66%，TZ1985EPSP合酶基因与土曲霉、烟曲霉、白曲霉和黑曲霉的同源性为90%，而与白假丝酵母、杜氏假丝酵母和热带假丝酵母的同源性为68%在进化关系上，TY-JMEPSP合酶和TZ1985EPSP合酶与真菌的EPSP合酶有很近的亲缘关系，而与植物和细菌的EPSP合酶亲缘关系比较远在植物中，一些EPSP合酶基因也被克隆与分析。

Wang等发现烟草中有两种EPSP合酶基因的cDNA，两种cDNA的长度分别为2000bp和1300bp，二者编码的氨基酸序列和核苷酸序列的同源性分别为95.9%和89%，但是两种EPSP合酶的酶活力相同刘晓军等从诸葛菜中也克隆出两段EPSP合酶基因片段，其中一段长为797bp，另一段长为1157bp，两个片段的外显子序列是完全相同的，内含子相差很大，但是这两段基因编码出相同的EPSP合酶，这两个片段所编码氨基酸序列与欧洲油菜、玉米、拟南芥、黑麦草、水稻及矮牵牛的一致性分别为85%、80%、83%、80%、79%和79%Gasser等通过对比细菌、植物和真菌的EPSP合酶编码区，获得了一个比较一致的模式（图5），三者EPSP合酶中约有38%的氨基酸残基相同，细菌和植物之间EPSP合酶的同源性为54%，真菌和植物之间EPSP合酶的同源性为38%，这些数据表明真菌和植物中的EPSP合酶的分枝比细菌和植物中此酶的分枝出现的早研究者发现EPSP合酶基因在生物不同的组织中表达也是有差异的，在矮牵牛中其基因表达量最高的组织是花瓣，在银杏中表达量最高的是在果实和叶子中；其次为茎，最低的是在根中木本植物喜树EPSP合酶基因表达量最高的组织是在叶子，根中表达量最低。

薤白EPSP合酶基因在幼叶中表达量最高。