第1章蛋白质的结构与功能.ppt

蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第 一一 章章Structure and Function of Protein1•第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成•第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构•第三节第三节 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能•第四节第四节 蛋白质的理化性质与分离提纯蛋白质的理化性质与分离提纯2蛋蛋 白白 质质 (protein)是是 由由 许许 多多 氨氨 基基 酸酸(amino acids)通通过过肽肽键键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物相连形成的高分子含氮化合物蛋蛋白白质质是是生生命命活活动动的的物物质质基基础础，，是是含含量量最最丰丰富富的的生生物物大大分分子子，，具具有有多多种种生生物物学学功能，称为功能大分子功能，称为功能大分子3蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1.蛋蛋白白质质是是各各组组织织的的主主要要有有机机成成分分，，干干重重45%，一般组织含，一般组织含17~20%2. 蛋白质具有重要的蛋白质具有重要的生物学功能生物学功能 1）催化功能）催化功能---酶酶 2）载运功能）载运功能---膜蛋白、血红蛋白膜蛋白、血红蛋白 3）运动功能）运动功能---鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白 4）防御功能）防御功能---免疫球蛋白免疫球蛋白 5）调控功能）调控功能---激素、生物活性肽激素、生物活性肽 6）结构功能）结构功能---皮、毛、骨、牙、细胞骨架皮、毛、骨、牙、细胞骨架 7）神经传导）神经传导---构成神经递质乙酰胆碱、五羟色构成神经递质乙酰胆碱、五羟色氨氨 。

3. 氧化供能氧化供能4蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第第 一一 节节5  蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要有主要有C、、H、、O、、N和和S 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量P或金属元素或金属元素Fe、、Cu、、Zn、、Mn、、Co、、Mo，个别蛋白质还，个别蛋白质还含有含有 I 6蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16％％ •通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：蛋白质含量蛋白质含量 ( g % ) = 含氮量含氮量( g % ) × 6.25  蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点7一、氨基酸一、氨基酸 ————蛋白质的基本组成单位蛋白质的基本组成单位存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，，且均属且均属 L- -氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）甘氨酸除外）8H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-氨基酸的通式氨基酸的通式R9什么是什么是α-氨基酸，氨基酸，L-型氨基酸？型氨基酸？—C—C—C—C—COOHαβγ— C — C — C — C(NH2) — COOH α-氨基酸氨基酸 — C — C — C (NH2) — C — COOH β-氨基酸氨基酸 — C — C (NH2) — C — C — COOH γ-氨基酸氨基酸 COOHNH2—C — H R COOHH—C — NH2 R COOHNH2—C — H R L-型AA COOHH—C — NH2 R D-型AA101.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类（按侧链基团的性质）（按侧链基团的性质）111、非极性疏水性氨基酸、非极性疏水性氨基酸•含有非极性的侧链，具有疏水性（含有非极性的侧链，具有疏水性（Gly除除外）外）•种类：种类：Gly、、 Ala、、 Val、、Leu、、Ile、、Phe、、 Pro121.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸132、极性中性氨基酸、极性中性氨基酸•侧链含有侧链含有-OH或或-SH、、-CONH2等极性等极性基团，具有亲水性，但在中性水溶液中基团，具有亲水性，但在中性水溶液中不电离。

不电离•种类：种类：Ser、、Thr、、Tyr、、Trp、、Cys、、Met、、Asn、、Gln142. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸(Trp)15•3、酸性氨基酸、酸性氨基酸•侧链含有侧链含有-COOH，易解离出，易解离出H+，具有酸性具有酸性•种类：种类：Asp、、Glu •4、碱性氨基酸、碱性氨基酸•侧链带有易接受侧链带有易接受H+的基团而具有碱性如的基团而具有碱性如ε-NH2、胍基和咪、胍基和咪唑基•种种类：：His、、Lys、、Arg 163. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸17　　习惯分类方法习惯分类方法1.芳香族氨基酸芳香族氨基酸：：Trp、、Tyr、、Phe2.含羟基氨基酸含羟基氨基酸：：Ser、、Thr、、Tyr3.含硫氨基酸含硫氨基酸：：Cys、、Met4.杂环族氨基酸：杂环族氨基酸：His5.杂环族亚氨基酸：杂环族亚氨基酸：Pro6.支链氨基酸支链氨基酸：：Val、、Leu、、Ile18　　几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸Gly：：无手性碳原子无手性碳原子Pro：：为环状亚氨基酸为环状亚氨基酸Cys：：可形成二硫键可形成二硫键19生蛋白氨基酸：生蛋白氨基酸：　　　　20种编码氨基酸种编码氨基酸非生蛋白氨基酸：非生蛋白氨基酸：　　蛋白质中不存在的氨基酸。

如：瓜氨酸、　　蛋白质中不存在的氨基酸如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的 修饰氨基酸：修饰氨基酸：　　　　蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸没有相应的编码如：胱氨酸、羟基酸没有相应的编码如：胱氨酸、羟脯氨酸（脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（）、羟赖氨酸（Hyl）20（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质2. 两性解离及等电点两性解离及等电点3. 紫外吸收紫外吸收 4. 茚三酮反应茚三酮反应 1. 旋光性旋光性21（二）（二） 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质（（1 1）） 旋光性旋光性除甘氨酸外，氨基酸均含有一个除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性手性 - -碳原碳原子，因此都具有旋光性子，因此都具有旋光性比旋光度比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据鉴别各种氨基酸的重要依据比旋光度的计算公式？比旋光度的计算公式？ 22（（2 2）） 氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收•构成蛋白质的构成蛋白质的20种氨种氨基酸在可见光区都没基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫有光吸收，但在远紫外区外区(<220nm)均有光均有光吸收。

吸收•在近紫外区在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力吸收光的能力23 组组成成天天然然蛋蛋白白质质分分子子的的20种种氨氨基基酸酸中中，，只只有有色色氨氨酸酸、、酪酪氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸对对紫紫外外光光有有光光吸吸收收其其吸吸收收峰峰在在280nm左左右右，，以以色色氨氨酸酸吸吸收收最强 可可利利用用此此性性质质采采用用紫紫外外分分分分光光度度法法测测定定蛋蛋白白质的含量质的含量Ø酪氨酸的酪氨酸的 max＝＝275nm，， 275=1.4×103;Ø苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max＝＝257nm，， 257=2.0×102;Ø色氨酸的色氨酸的 max＝＝280nm，， 280=5.6×103;24 氨基酸分子是一种两性电解质氨基酸分子是一种两性电解质 氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液氨基酸分子带有相等正、负电荷时，溶液pH值称为该氨基酸的值称为该氨基酸的等电点等电点（（pI） （（3 3）） 两性解离及等电点两性解离及等电点25•氨基酸等电点的确定：氨基酸等电点的确定：•氨氨基基酸酸的的等等电电点点可可由由其其分分子子上上解解离离基基团团的的解解离离常常数来确定。

数来确定PH 1 7 10净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI26Ø 侧链不含离解基团的中性氨基酸，侧链不含离解基团的中性氨基酸， pI = (pK′1 + pK′2 )/2 Ø对对于于侧侧链链含含有有可可解解离离基基团团的的氨氨基基酸酸，，其其pI值值也也决定于两性离子两边的决定于两性离子两边的pK′值的算术平均值值的算术平均值 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK′1 + pK′2 )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pK′2 + pK′3 )/2 27Ø与茚三酮的反应与茚三酮的反应---AA定性和定量的测定方法定性和定量的测定方法Ø与甲醛的反应与甲醛的反应---测定游离氨基量。

测定游离氨基量Ø桑格反应桑格反应---N端的测定方法端的测定方法Ø艾德曼反应艾德曼反应---N端的测定方法端的测定方法Ø与荧光胺反应与荧光胺反应---AA含量的测定方法含量的测定方法Ø与与5,5’-双双硫硫基基-双双(2-硝硝基基苯苯甲甲酸酸)反反应应—半半胱胱氨酸含量的测定氨酸含量的测定（（4 4）） 氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质(P10)(P10)28 原理：原理： 氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸 + + + + 茚三酮试剂茚三酮试剂茚三酮试剂茚三酮试剂 篮紫色化合物篮紫色化合物篮紫色化合物篮紫色化合物 吸收峰吸收峰: :570nm 茚三酮反应茚三酮反应用途：用途：氨基酸的定量氨基酸的定量 29（（5）） 氨基酸的显色氨基酸的显色氨氨 基基 酸酸 显显 色色 试试 剂剂 颜颜 色色各各种种氨氨基基酸酸 0.1％％-0.5％％茚茚三三酮酮丙丙酮酮(或或乙乙醇醇)溶溶液液 蓝紫色蓝紫色多多种种氨氨基基酸酸 1％％吲吲哚哚醌醌酒酒精精冰冰醋醋酸酸溶溶液液 不不同同氨氨基基酸酸显显不不同颜色同颜色各各种种氨氨基基酸酸 1％％澳澳酚酚蓝蓝酒酒精精溶溶液液 蓝蓝 色色甘甘 氨氨 酸酸 0.1％％ 邻邻 苯苯 二二 醛醛 酒酒 精精 溶溶 液液 墨绿色墨绿色酪酪 氨氨 酸酸 a-亚亚硝硝基基-B—萘萘酚酚酒酒精精硝硝酸酸溶溶液液 红红 色色酪酪 氨氨 酸酸 对对 氨氨 基基 苯苯 磺磺 酸酸 -碳碳 酸酸 钠钠 溶溶 液液 浅红色浅红色组组 氨氨 酸酸 对对 氨氨 基基 苯苯 磺磺 酸酸 -碳碳 酸酸 钠钠 溶溶 液液 橘红色橘红色丝丝 氨氨 酸酸 碘碘酸酸钠钠甲甲醇醇溶溶液液及及醋醋酸酸铵铵处处理理 黄黄 色色精精 氨氨 酸酸 尿尿素素萘萘酚酚酒酒精精溶溶液液、、氢氢氧氧化化钠钠溴溴溶溶液液 红红 色色半半 胱胱 氨氨 酸酸 亚亚 硝硝 酸酸 铁铁 氰氰 化化 钠钠 甲甲 醇醇 溶溶 液液 红红 色色脯脯 氨氨 酸酸 吲吲 哚哚 醌醌 -醋醋 酸酸 锌锌 异异 丙丙 醇醇 溶溶 液液 蓝蓝 色色色色 氨氨 酸酸 对对 甲甲 基基 苯苯 甲甲 醛醛 丙丙 酮酮 溶溶 液液 蓝紫色蓝紫色30二、肽二、肽* 肽肽键键(peptide bond)：：是是由由一一个个氨氨基基酸酸的的 -羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的 -氨氨基基脱水缩合而形成的化学键。

脱水缩合而形成的化学键一）肽（一）肽(peptide)31•多肽链多肽链(polypeptide chain)多个多个AAs通过通过肽键相连而成的多聚体肽键相连而成的多聚体•二肽（二肽（dipeptide））•三肽三肽(tripeptide)•寡肽寡肽(oligopeptide) <10 AAs•多肽多肽(polypeptide) >10 AAs32•氨基酸残基氨基酸残基(amino acid residue)•肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而稍有残缺，称为氨基酸肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而稍有残缺，称为氨基酸残基•氨基末端（氨基末端（amino terminal）和羧基末端（）和羧基末端（carboxyl terminal））Ø 通常在多肽链的一端含有一个游离的通常在多肽链的一端含有一个游离的 -氨基，称为氨基，称为氨氨基端或基端或N-端端(H)；；在另一端含有一个游离的在另一端含有一个游离的 -羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或C-端端(OH)Ø 氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-端氨端氨基酸残基为终点的排列顺序。

如上述五肽可表示为：基酸残基为终点的排列顺序如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln•主链（主链（C-C-N-C）和侧链）和侧链(R)33多肽链多肽链34 多肽链多肽链35•蛋白质与多肽的界线：蛋白质与多肽的界线：•>胰岛素（胰岛素（5733）为蛋白质）为蛋白质•<胰岛素（胰岛素（5733）为多肽）为多肽36（二）（二） 几种生物活性肽几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, GSH)结构结构: :37•谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽三肽•谷氨酸的谷氨酸的 -羧基羧基形成肽键形成肽键•－－SH为活性基团为活性基团•为为酸性肽酸性肽•是体内重要的是体内重要的还原剂还原剂38GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ 主要功能主要功能: :（（1）作为还原剂，保护蛋白质或酶的巯基免）作为还原剂，保护蛋白质或酶的巯基免遭氧化2）作为还原剂，清除体内的）作为还原剂，清除体内的H2O2。

3）保护核酸和蛋白质免遭毒物损害保护核酸和蛋白质免遭毒物损害39•肽类激素：化学本质是寡肽或多肽的激素如肽类激素：化学本质是寡肽或多肽的激素如促甲状腺素释放激素（促甲状腺素释放激素（TRH））2. 肽类激素及神经肽肽类激素及神经肽40u神经肽神经肽(neuropeptide)：在神经传导过程：在神经传导过程中起信号转导作用的肽类中起信号转导作用的肽类u脑啡肽（脑啡肽（5肽）肽）u强啡肽（强啡肽（17肽）肽）u内啡肽（内啡肽（31肽）肽）41三、蛋白质的分类三、蛋白质的分类 * * 根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质：单纯蛋白质： 氨基酸氨基酸 如清蛋白、球蛋白如清蛋白、球蛋白结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分（称为辅基）（称为辅基）42•辅基：辅基：结合蛋白质中的结合蛋白质中的非蛋白部分非蛋白部分，绝大，绝大部分辅基是通过部分辅基是通过共价键共价键与蛋白部分相连，与蛋白部分相连，辅基与蛋白质的功能密切相关包括辅基与蛋白质的功能密切相关包括糖、糖、脂、核酸、磷酸、色素和金属离子脂、核酸、磷酸、色素和金属离子等。

等43•根据蛋白质形状根据蛋白质形状•球状蛋白质：球状蛋白质：分子长轴：短轴分子长轴：短轴<10，多数可溶于，多数可溶于水亲水基团位于分子表面，疏水基团位于分子水亲水基团位于分子表面，疏水基团位于分子内部•纤维状蛋白：纤维状蛋白：分子长轴：短轴分子长轴：短轴>10，难溶于水难溶于水如胶原蛋白，多作为结构蛋白）（如胶原蛋白，多作为结构蛋白）44蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein 第第 二二 节节45蛋白质的分子结构包括：蛋白质的分子结构包括： 一级结构一级结构 (primary structure)二级结构二级结构 (secondary structure)三级结构三级结构 (tertiary structure)四级结构四级结构 (quaternary structure)高级结构高级结构46定义：定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序排列顺序一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要化学键：主要化学键：肽键肽键 二硫键二硫键一级结构是由遗传信息决定的。

一级结构是由遗传信息决定的一级结构是蛋白质空间结构的基础一级结构是蛋白质空间结构的基础47一级结构是蛋白质空间构象和特异生一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础物学功能的基础胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构302148二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一段段肽肽链链的的局局部部空空间间结结构构，，即即该该段段肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子的的相相对对空空间间位位置置，，并并不不涉涉及及氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链的构象的构象 定义：定义：稳定因素稳定因素：： 在肽键的羰基氧和亚氨基氢在肽键的羰基氧和亚氨基氢之间形成的之间形成的氢键氢键 49（一）肽单元（一）肽单元 (peptide unit) 参参与与组组成成肽肽键键的的6个个原原子子（（-Cα-CO-NH-C α- ））位位于于同同一一平平面面，，又又叫叫酰酰胺胺平平面面或或肽肽键键平平面面它它是是蛋蛋白白质质构构象象的的基基本本结结构构单位50肽单元肽单元HHHH51•肽单元结构特点：肽单元结构特点：（（1）肽键的）肽键的C-N键长介于单键和双键之间，具有部键长介于单键和双键之间，具有部分双键性质，不能自由旋转。

分双键性质，不能自由旋转2）肽键的）肽键的-C=O和和-N-H及及两个两个Cα均为反式构型均为反式构型3）与）与Cα相相连的的单键可自由旋可自由旋转，， Cα-C旋旋转角度角度以以ψψ（（psipsi）表示，）表示， Cα-N旋旋转角以角以φφ表示，即两表示，即两面角这样这样，两个相，两个相邻肽单邻肽单元可以元可以围绕围绕一个共用一个共用的的Cα自由旋自由旋转，而造成两个，而造成两个肽单元在空元在空间的不同的不同位置这就是就是肽链折叠、折叠、盘曲的基曲的基础5253 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式• 1、、 -螺旋螺旋 (   -helix ) • 2、、 -折叠折叠 (  -pleated sheet )• 3、、 -转角转角 (  -turn )• 4、无规卷曲、无规卷曲 ( random coil ) 54（二）（二）  -螺旋螺旋结构要点结构要点: ①①多肽链主链围绕中心轴形成多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋右手螺旋，，侧链侧链伸向螺旋外侧伸向螺旋外侧 ②②每圈螺旋含每圈螺旋含3.6个氨基酸个氨基酸，螺距为，螺距为0.54nm。

③③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定成的氢键保持螺旋稳定氢键氢键与螺旋长轴基本平与螺旋长轴基本平行555657l（（2）影响）影响αα-螺旋形成的因素螺旋形成的因素l①①氨基酸侧链所带电荷（如酸性或碱性氨氨基酸侧链所带电荷（如酸性或碱性氨基酸）基酸）Asp Glu, Arg LysAsp Glu, Arg Lysl②②氨基酸侧链的大小（如氨基酸侧链的大小（如Asn、Leu Gly Gly））l③③氨基酸侧链的形状氨基酸侧链的形状（如（如ProPro没有多余的氢形成氢没有多余的氢形成氢键，且键，且αα-C C原子位于五元环上，其原子位于五元环上，其C-NC-N键不能自由旋转，键不能自由旋转，难以形成难以形成αα-螺旋螺旋 ））58（三）（三） - -折叠折叠①①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯锯齿状齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方结构，侧链位于锯齿结构的上下方 ②②两段以上的两段以上的β -折叠结构折叠结构平行排列平行排列 ，两链间，两链间可可顺向顺向平行，也可平行，也可反向反向平行平行 。

③③两链间的肽键之间形成两链间的肽键之间形成氢键氢键，以稳固，以稳固β -折叠折叠结构氢键与主链长轴结构氢键与主链长轴垂直垂直ΒΒ- -折叠形成条件：要求氨基酸侧链较小折叠形成条件：要求氨基酸侧链较小 596061平行式平行式反平行反平行式式ββ- -折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型62（四）（四） - -转角和无规卷曲转角和无规卷曲 - -转角：转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构 ① ① 肽链内形成肽链内形成180180º º回折②②含含4 4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键第四个形成氢键③ ③ 第二个氨基酸残基常为第二个氨基酸残基常为ProPro63 - -转角：转角：64α螺旋螺旋β折叠片折叠片β转角转角自由回转自由回转65RNase的分子结构的分子结构α-α-螺旋螺旋β-β-折迭折迭β-β-转角转角无规卷曲无规卷曲66（五）模体（（五）模体（motif) motif) 蛋白质分子中，二个或三个具有二级蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体个具有特殊功能的空间构象，被称为模体(motif)。

又称超二级结构、模序）又称超二级结构、模序）n形式：形式： α α         α   螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋67 组合组合 组合组合 组合组合motif 的常见组合的常见组合68螺旋－环－螺旋螺旋－环－螺旋 锌指锌指69（六）分子伴侣（（六）分子伴侣（chaperon））概念：帮助新生多肽链正确折叠的一类蛋白质概念：帮助新生多肽链正确折叠的一类蛋白质作用：作用：1、可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合，防止、可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合，防止错误折叠错误折叠2、与错误折叠的肽段结合，诱导其正确折叠与错误折叠的肽段结合，诱导其正确折叠3、对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要作、对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要作用70•维持蛋白质二级结构的作用力是维持蛋白质二级结构的作用力是？？•肽键衍生而来的氢键肽键衍生而来的氢键•纤维状蛋白只有二级结构，例如毛发与肌纤维状蛋白只有二级结构，例如毛发与肌肉蛋白肉蛋白71•电子显微镜下的人体头发电子显微镜下的人体头发72大纤维鳞状细胞皮层细胞微纤维微微纤纤维维原原纤纤维维 α螺螺旋旋烫发时烫发时还原剂还原剂加氧化剂形成新加氧化剂形成新的错位的二硫键的错位的二硫键好了好了73三、蛋白质的三级结构三、蛋白质的三级结构非共价键：非共价键： 疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van Van derder WaalsWaals力等力等。

共价键：共价键： 二硫键二硫键 稳定因素：稳定因素：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置即肽链中所有原子在三维空间的排布位置即肽链中所有原子在三维空间的排布位置定义定义 74氢键：氢键：连在电负性强的半径小的原子上的氢与另一连在电负性强的半径小的原子上的氢与另一个电负性强的原子之间的相互作用个电负性强的原子之间的相互作用 -C=O……H-O-H -C=O……H-N-75疏水键疏水键: 疏水基团在水中避开水而聚集在一起的作用疏水基团在水中避开水而聚集在一起的作用力 Ala，，Leu，，Ile，，Trp，，Pro范德华力范德华力（（Van der Waals力）：分子间的静力）：分子间的静电引力0.3~0.5nm76盐键（离子键）：盐键（离子键）：正负离子间的静电引力正负离子间的静电引力 带正电的基团：带正电的基团： αα- -NH3 3+ + Lys Lys的的ε-NH3 3 + + His的咪的咪唑基基 Arg的胍基的胍基 带负电的基的基团：： αα-COOCOO- Asp Asp的的 β-COO- Glu的的γ-ＣＣOO- -NH3+ ……-OOC- 7778• 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端79纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 结构域结构域 (domain) 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。

属于行其功能，称为结构域属于超二级结构超二级结构80结构域结构域Triose phosphate isomerase81维系四级结构的化学键维系四级结构的化学键：非共价键：非共价键亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是疏水键、氢键、疏水键、氢键、盐键、范德华力盐键、范德华力四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构蛋白质分子中每条具有完整三级结构的多蛋白质分子中每条具有完整三级结构的多肽链，称为肽链，称为亚基亚基 (subunit)（或亚单位）或亚单位）82血红蛋白（血红蛋白（Hb）的四级结构）的四级结构838485蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节86（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键87 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、β-β-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、β-β-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性88（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Glu · Glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链肽链HbA β 肽肽 链链N-Val · His · Leu · Thr · Pro · Val · Glu · · · · ·C(146) 89 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为““分子病分子病””。

90（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 91Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，， Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数（称数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变浓度变化而改变二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 92肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线93蛋白质四级结构与功能的关系蛋白质四级结构与功能的关系 ——变构效应（变构效应（allosteric effect）） 当当血血红红蛋蛋白白的的一一个个α亚亚基基与与氧氧分分子子结结合合以以后后，，可可引引起起其其他他亚亚基基的的构构象象发发生生改改变变，，对对氧氧的的亲亲和和力力增增加加，，从从而而导导致致整整个个分分子子的的氧氧结结合合力力迅迅速速增增高高，，使使血血红红蛋蛋白白的的氧氧饱饱和和曲曲线线呈呈“S”形形。

这这种种由由于于蛋蛋白白质质分分子子构构象象改改变变而而导导致致蛋蛋白白质质分分子子功功能能发发生生改改变变的的现现象象称称为为变变构构效效应应（（别别构构现现象象））所所对对应应的的蛋蛋白白称称为为变变构构蛋蛋白白，，例如血红蛋白、变构酶例如血红蛋白、变构酶 94(R)relaxed state(T) tense state 血中氧分子的运送：Lung氧氧分分子子HemoglobinHemoglobinMyoglobinMyoglobinMuscle静脉动脉环境氧高时Hb 快速吸收氧分子环境氧低时Hb 迅速释放氧分子释放氧分子后Hb 变回 T state任何一个亚基接受氧分子后，会增进其它亚基吸附氧分子的能力95* 协同效应协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应 促进作用称为促进作用称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)抑制作用称为抑制作用称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)96变构效应变构效应(allosteric effect)凡凡蛋蛋白白质质（（或或亚亚基基））因因与与某某小小分分子子物物质质相相互互作作用用而而发发生生构构象象变变化化，，导导致致蛋蛋白白质质（（或或亚基）功能的变化，称为蛋白质的亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应变构效应。

97（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象病病：：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，，仍仍可可影影响响其其功功能能，，严严重重时时可可导导致致疾病发生疾病发生98蛋白质构象病的机理：蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变粉样纤维沉淀的病理改变这类疾病包括：这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等99疯牛病疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变引起的一组人和动物神经退行性病变正常的正常的PrP富含富含α-螺旋，称为螺旋，称为PrPcPrPc在在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的折叠的PrPsc，，从而致病。

从而致病PrPcα-螺旋螺旋PrPscβ-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病100第四节第四节蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein101l一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质l1、蛋白质的两性电离、蛋白质的两性电离l2、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质l3、蛋白质的变性、沉淀和凝固、蛋白质的变性、沉淀和凝固l4、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收l5、蛋白质的呈色反应、蛋白质的呈色反应102（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，，在在一一定定的的溶溶液液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 103蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 　　　　当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，，即即成成为为兼兼性性离离子子，，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。

蛋白质的等电点　　　　利利用用蛋蛋白白质质两两性性电电离离的的性性质质，，可可通通过过电电泳泳、、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质104•pH>pI pH>pI 带负电荷带负电荷•pH

为胶粒范围之内 * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜胶体性质：溶于水、胶体性质：溶于水、 不通透性、布朗运动、丁道尔现象、电泳现象不通透性、布朗运动、丁道尔现象、电泳现象106（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 1、蛋白质的变性、蛋白质的变性(denaturation)　　在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分　　在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失质改变和生物活性的丧失107• 造成变性的因素：造成变性的因素：物理因素：加热、加压、超声波、紫外线、物理因素：加热、加压、超声波、紫外线、化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、化学因素：乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、ββ- -巯基乙醇、重金属离子及生物碱试剂等巯基乙醇、重金属离子及生物碱试剂等 • 变性的本质：变性的本质：———— 破坏破坏非共价键和二硫键非共价键和二硫键，不改变蛋，不改变蛋白质的一级结构白质的一级结构108• 应用举例应用举例Ø临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。

重金属盐中毒吃大量乳品或蛋清（生）重金属盐中毒吃大量乳品或蛋清（生）Ø防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件如疫苗等）的必要条件 • 蛋白质变性后的性质改变：蛋白质变性后的性质改变：　　　　溶解度降低溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失生物活性丧失及及易受蛋白酶水解易受蛋白酶水解109若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，，去去除除变变性性因因素素后后，，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的的构构象和功能，称为象和功能，称为复性复性不可逆变性不可逆变性复性复性(renaturation)110 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、β-β-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、β-β-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性111* 2、蛋白质沉淀、蛋白质沉淀　　　　 维维持持蛋蛋白白质质胶胶体体系系统统稳稳定定性性的的因因素素被被破破坏坏，蛋白质就可能产生沉淀蛋白质就可能产生沉淀 112+++++++带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜++++++++带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的沉淀溶液中蛋白质的沉淀113•引起蛋白质沉淀的因素：引起蛋白质沉淀的因素：•加高浓度盐类加高浓度盐类 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等•加有机溶剂加有机溶剂 酒精、丙酮等酒精、丙酮等•加重金属盐加重金属盐 氯化高汞、硝酸银、硝酸铅氯化高汞、硝酸银、硝酸铅 及三氯化铁等及三氯化铁等•加某些酸类加某些酸类 苦味酸、单宁酸、三氯乙酸苦味酸、单宁酸、三氯乙酸 等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。

等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀•变性与沉淀的关系：变性与沉淀的关系：•变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性并不变性114•* 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) •　　　　蛋白质经强酸、强碱作用变性后，仍能溶解蛋白质经强酸、强碱作用变性后，仍能溶解于强酸强碱溶液中，若将于强酸强碱溶液中，若将pH调至调至pI，则变性蛋白，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中如再加热则絮状物可变成比较于强酸和强碱中如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用这种现象称为蛋白质的凝固作用115（四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收收峰峰蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定定量测定。

量测定116（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应⒈⒈茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应生成蓝紫色化合物三酮反应生成蓝紫色化合物 ⒉⒉双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液中与在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度117二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)：：利用利用透析袋把大分子蛋白质与透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法小分子化合物分开的方法将蛋白溶液装入用半透膜将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析物除去，这种方法叫透析如在袋外放吸水剂（如聚如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的乙二醇）还可达到浓缩的目的。

目的应用：除盐和浓缩应用：除盐和浓缩118119•超滤法超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的缩蛋白质溶液的目的•超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用化中有广泛的应用120（二）丙酮沉淀、盐析（二）丙酮沉淀、盐析*使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，，必必须须在在0～～4℃℃低低温温下下进进行行，，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液体体积积蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，，应应立立即即分分离离除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀外，也可用乙醇沉淀 *盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，，导导致致蛋蛋白白质沉淀 121（三）电泳（三）电泳蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。

这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质的技术质的技术, 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 由由于于不不同同的的蛋蛋白白质质带带电电多多少少、、分分子子量量大大小小及及分分子子形形状状不不同同，，因因此此在在电电场场中中泳泳动动的的速速度度就就不同，从而可将蛋白质分离开来不同，从而可将蛋白质分离开来122根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量：常用于蛋白质分子量的测定等电聚焦电泳等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法蛋白质的电泳方法双向凝胶电泳：双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术是蛋白质组学研究的重要技术123（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。

124蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离质不同进行分离 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离利用各蛋白质分子大小不同分离125126127（五）超速离心（五）超速离心•超超速速离离心心法法(ultracentrifugation) 不不同同蛋蛋白白质质的的密密度度与与形形态态各各不不相相同同，，在在离离心心力力场中沉降的速度也不同，从而将其分离场中沉降的速度也不同，从而将其分离•既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定蛋白质的分子量定蛋白质的分子量 *蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation coefficient, S)表表示示,沉沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关 128•S S大体上与蛋白质分子量呈正比关系大体上与蛋白质分子量呈正比关系•S S与蛋白质的密度和形状有关与蛋白质的密度和形状有关。

•如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小数小————沉降快；而疏松颗粒的摩沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大；擦系数大；————沉降慢•应用：蛋白质的分离纯化和测分子应用：蛋白质的分离纯化和测分子量129复习题•1、名词解释、名词解释•肽单元、一、二、三、四级结构肽单元、一、二、三、四级结构•2、蛋白质的基本组成单位是什么？有多少、蛋白质的基本组成单位是什么？有多少种？按侧链的结构和功能不同，可分为几种？按侧链的结构和功能不同，可分为几类？各包括哪些氨基酸？类？各包括哪些氨基酸？•3、蛋白质的二级结构有几种？各有何特征，、蛋白质的二级结构有几种？各有何特征，由什么化学键维持？由什么化学键维持？130•4、什么是蛋白质变性？变性因素有哪些？、什么是蛋白质变性？变性因素有哪些？变性本质是什么？变形后有什么改变？变性本质是什么？变形后有什么改变？•5、何为蛋白质的等电点？当、何为蛋白质的等电点？当pH>pI时，蛋时，蛋白质带何种电荷？当白质带何种电荷？当pH

基酸顺序的结果一）改进的（一）改进的Sanger法法132水解肽链的方法及特征水解肽链的方法及特征裂解剂裂解剂裂解位点裂解位点胰蛋白酶胰蛋白酶Lys、、Arg（（C））胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶Phe、、Tyr、、Trp（（C））弹性蛋白酶弹性蛋白酶Ala、、Gly、、Ser、、Val（（C））胃蛋白酶胃蛋白酶Phe、、Trp、、Tyr（（N））溴化氰溴化氰Met（（C））羟胺羟胺Asn—Gly133通过核酸推演的方法通过核酸推演的方法按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列134。