研究代表者坂口志文（京都大学再生医科学研究所.pdf

戦略的創造研究推進事業 ＣＲＥＳＴ 研究領域「免疫難病・感染症などの先進医療技術」 研究課題 「制御性 T 細胞による新しい免疫制御法の開発」 研究終了報告書 研究期間 平成１５年１０月～平成２１年３月 研究代表者：坂口志文 （京都大学再生医科学研究所 生体機能調節学 教授） －1－ §１ 研究実施の概要 §１ 研究実施の概要 1.1 研究の構想 制御性 T 細胞（Regulatory T cells、以下 Treg と略）は、ヒトを含め哺乳動 物の正常個体中に存在し、免疫応答に対する“負”の制御を司るその異常は、 正常自己組織に対する異常免疫応答としての自己免疫病（例えばⅠ型糖尿病、 甲状腺炎） 、過剰免疫反応としてのアレルギー、炎症性腸疾患など様々な免疫病 の原因となる一方、Treg の操作により、このような免疫病の治療・予防が可 能であるさらに、Treg 数の減少、機能減弱化を図れば、癌細胞に対する免疫 応答を惹起、強化でき、逆に、Treg 数の増加、機能強化により、移植臓器に対 する拒絶反応を抑制すれば、安定な移植免疫寛容を導入できる即ち、免疫系 に生理的に備わった免疫制御機構である Treg を標的として、病的および生理的 な免疫応答制御が可能である。

本研究の狙いは、Treg による免疫システム制御 という新たな概念に基づき、アレルギー・自己免疫疾患、難治感染症、悪性腫 瘍の治療と予防、また移植免疫寛容の誘導など、新たな免疫治療法の基礎を確 立しようとすることにある 1.２ 研究の実施と成果 本研究では、現在までに以下の成果を上げた （１） Treg の発生・機能における Foxp3 の役割 CD25+CD4+Treg の発生 ・ 分化に Foxp3 遺伝子が必須であることを見出した Foxp3 は転写因子をコードしており、ヒトの遺伝性免疫疾患 IPEX（immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome）の原 因遺伝子であるFoxp3 は、胸腺、末梢の CD25+CD4+Treg に特異的に発現してい るだけでなく、通常Ｔ細胞に Foxp3 を強制発現させると、機能的にも表現型で も Treg 様に転換でき、そのようにして作製した Treg は生体内で自己免疫性炎 症を抑制できた（Hori et al., Science, 2003） 。

即ち、Foxp3 は、Treg の発生・ 機能のマスター制御遺伝子であるヒト FOXP3 遺伝子は、ヒト Treg にも特異的 に発現しており、ヒトＴ細胞に FOXP3 遺伝子を強制発現させ機能的に Treg 様に 転換できる（Yagi et al., Int. Immunol., 2004） この結果は、Foxp3 遺伝子 操作によるヒト自己免疫病、炎症性疾患の治療が可能であることを意味する Treg の発生、機能を解明すべく、Foxp3 が制御する遺伝子群をマイクロアレ イ法により網羅的に探索したところ、Gpr83、Helios など、制御性Ｔ細胞に特異 的に発現しかつ創薬の標的となりうる興味深い分子を同定し、そのような分子 に対する単クローン抗体の作製を試みている（Sugimoto et al., Int. Immunol., 2006） さらに、 Yeast-two-hybrid 法を用いて、 Foxp3 に結合する分子を探索し、 転写因子 AML1/Runx1 が Foxp3 に特異的に会合することを見出した（Ono et al., Nature, 2007） AML1/Runx1 は、通常のＴ細胞では IL-2、IFN－γなどのサイトカ イン遺伝子の発現を亢進させるが、Treg では Foxp3 と結合することによってサ イトカイン産生を抑制するのみならず抑制能の発現に働く。

さらにこの分子会 合に介入し Treg 機能を制御できる可能性を示した Foxp3 が直接に結合する遺伝子群は 100-200 個と考えられるが、その中で－2－ Treg 機能に重要な分子として IL-2 と CTLA-4（下記）の解析を進めた即ち、 正常マウスで、抗 IL-2 抗体の投与により、IL-2 を一定期間中和すれば、Treg が減少し、Treg 除去によって誘導されるのと同様の自己免疫病を誘導できた （Setoguchi et al., J. Exp. Med., 2005） この結果は、CD25 (IL-2R α鎖)分 子は、Treg の単なる分子マーカーではなく、Treg 機能に不可欠であり、IL-2 は 末梢での Treg の生存に必須のサイトカインであることを意味する （２）Treg 機能の分子機構 Foxp3 の発現によって正常Ｔ細胞を、 Treg 機能を有するＴ細胞に転換できる Foxp3 がどのような遺伝子の発現を制御し抑制活性を発揮するかについて解析 を進めたFoxp3 promoter 制御下に Cre 蛋白を発現させるノックインマウス、 CTLA-4 遺伝子に loxP 部位を挿入したノックインマウスを作製し、 これらのマウ スを掛け合わせて、 Treg 特異的に CTLA-4 を欠損させた条件的ノックアウトマウ スを作製したところ、マウスは致死的自己免疫病、アレルギーを発症した（Wing et al., Science, 2008） 。

その Treg 抑制活性も大幅に失われていたこのよう なマウスでは腫瘍免疫も亢進しており、大部分のマウスは自家腫瘍を拒絶した 制御性Ｔ細胞における CTLA-4 の役割を解析し、その重要な機能として、CTLA-4 と抗原提示細胞上の CD80/CD86 分子との相互作用の結果、 CD80/CD86 分子の発現 が抑制され、その結果、他のＴ細胞の活性化が阻害されるとの結果を得た （Fehervari et al., Int. Immunol. 2004、Onishi et al., PNAS 2008） （３）Treg の分子操作による免疫応答制御 CTLA-4 分子を含めて、Treg に発現する分子の操作により免疫応答の抑制ある いは亢進が可能である例えば、Treg 特異的に発現する分子群に対する単クロ ーン抗体を作製したところ、そのひとつは、４型葉酸受容体(FR4)を認識してい たさらに、FR4 と葉酸の結合を阻害する単クローン抗体をマウスに投与したと ころ、活性化 Treg を減少させ、その結果、強力な腫瘍免疫を惹起できた （Yamaguchi et al., Immunity, 2007） 。

また、FR4 を強発現するＴ細胞を調整 し、増やすことで移植臓器に対する免疫寛容を誘導できた即ち、FR4 は、Treg の特異的マーカーとなるだけでなく、Treg を標的とした創薬につながると期待 できるTreg は GITR (glucocorticoid-induced TNF receptor- family-related gene/protein)を高発現する（Ono et al., J. Immunol., 2006） 抗 FR４抗体と 同じく、抗 GITR あるいは抗 GITR および抗 CTLA-４抗体の全身的制御、腫瘍内へ の局所投与で Treg による抑制を解除し、強い腫瘍免疫を惹起できることを示し た（Ko et al., J. Exp. Med. 2006、他） さらに、臓器移植についても、Treg を試験管内アロ抗原特異的増殖により増殖させ宿主に戻すことにより移植免疫 寛容を誘導できた（Nishimura et al., Int. Immunol. 2004、他） 1.3 今後の展望 Foxp3+Treg はあらゆる免疫応答の“負”の制御に関与している今後、その 発生・機能の分子、細胞レベルの研究をさらに進め、ヒトの病的、生理的免疫 応答制御への応用を図りたい。

－3－ §２ 研究構想及び実施体制 §２ 研究構想及び実施体制 (1) 研究構想 免疫応答の抑制的制御は、免疫自己寛容、また生体の恒常性の維持に重要で あるCD25+CD4+制御性 T 細胞は、正常個体の末梢に生理的に存在する特異な T 細胞集団であり、 免疫応答を抑制的に制御する この細胞集団の機能的異常は、 ヒトの自己免疫疾患、アレルギーなどの直接原因となりうる従って、この制 御性 T 細胞群の機能を明らかすれば、ヒト自己免疫病の新しい治療法につなが るまた、制御性 T 細胞の機能を人為的に弱めて免疫応答を増強すれば、難治 感染症や悪性腫瘍に対する免疫応答の増強による免疫療法の開発が可能となる 一方、制御性 T 細胞を抗原特異的に増強できれば、移植片に対して特異的免疫 寛容状態を誘導できようそのため、本研究では、CD25+CD4+制御性 T 細胞の産 生機構、抑制機能を、分子レベル、細胞レベル、個体レベルで解明することを 目標にしている即ち、制御性 T 細胞上に発現する抑制機能分子、増殖・活性 化に関与する分子を同定し、抑制機構、増殖・活性化機構を解明するまた、 それらの胸腺内、末梢での発生・分化機構を解明する。

その展開として、制御 性 T 細胞による自己免疫病治療法の開発、制御性 T 細胞機能の強化による移植 免疫寛容導入法、あるいは減弱による腫瘍免疫誘導法、さらに制御性 T 細胞機 能の操作による感染症・アレルギー治療法を開発するこれらの方法を用いて 前臨床的研究につなげる (2)実施体制 グループ名 研究代表者又は 主 たる共同研究者氏 名 所属機関・部署・役職名 研究題目 坂口志文グループ 坂口志文 京都大学再生医科学研究所・生体機能調節学分野・教授 制御性Ｔ細胞による新しい免疫制御法の開発 §３ 研究実施内容及び成果 §３ 研究実施内容及び成果 （１）制御性 T 細胞上に発現する抑制機能分子の同定制御性 T 細胞上に発現する抑制機能分子の同定 制御性 T 細胞の発生、分化に重要ないくつかの分子を同定、解析し、抑制機 能の解析を分子レベルで進めた 1. Foxp3.Foxp3. FOXP3 は 、 ヒ ト の 遺 伝 性 疾 患 IPEX (Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome)の原因遺伝子である。

本疾患が、制御性 T 細胞の除去による自己免疫疾患と酷似していることから、 Foxp3 が制御性 T 細胞の発生、機能に果たす役割を解析したその結果、Foxp3 が、マウスの胸腺、末梢 CD25+CD4+T 細胞に特異的に発現しており、レトロウイ ルスを用いて正常マウス、ヒトのナイーブ T 細胞に Foxp3 を導入すれば制御性 Ｔ細胞に転換できることを示した 以上の結果は、 Foxp3が制御性T細胞の発生、 機能のマスターコントロール遺伝子であることを意味するまた、Foxp3 遺伝子－4－ 操作による自己免疫病・炎症性疾患の治療が可能であることを示唆する 2. CTLA-4.CTLA-4. Foxp3 遺伝子の発現により抑制機能が発現することから、Foxp3 に よって制御される下流遺伝子の産物が抑制機能を担うと考えられるそのよう な分子のひとつとして CTLA-4 (cytotoxic lymphocyte-associated antigen-4) に焦点を当てた 我々の以前の実験では、 抗 CTLA-4 抗体を一定期間投与すれば、 制御性Ｔ細胞の除去によるのと相同の自己免疫病が誘導でき、また試験管内で CTLA-4 をブロックすれば抑制を解除できた。

しかしながら、 これ。