引物设计原则(必看).docx

mi 引物设计原则1、 引物得长度一般为 15-30 bp,常用得就是 18-27 bp,但不应大于 38,由于过长会导致其延长温度大于 74℃,不适于 Taq DNA 聚合酶进展反响2、 引物序列在模板内应当没有相像性较高,尤其就是 3’端相像性较高得序列,否则简洁导致错配引物 3’端消灭 3 个以上得连续碱基,如 GGG 或 CCC,也会使错误引发机率增加3、 引物 3’端得末位碱基对 Taq 酶得 DNA 合成效率有较大得影响不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为 A 得错配效率明显高于其她 3 个碱基,因此应当避开在引物得 3’端使用碱基 A另外,引物二聚体或发夹构造也可能导致 PCR 反响失败5’端序列对 PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物4、 引物序列得 GC 含量一般为 40-60%,过高或过低都不利于引发反响上下游引物得 GC 含量不能相差太大5、 引物所对应模板位置序列得 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最正确Tm 值得计算有多种方法,如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在 Oligo 软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6、 ΔG 值就是指 DNA 双链形成所需得自由能,该值反映了双链构造内部碱基对得相对稳定性应中选用 3’端 ΔG 值较低(确定值不超过 9),而 5’端与中间 ΔG 值相对较高得引物引物得 3’端得 ΔG 值过高,简洁在错配位点形成双链构造并引发 DNA 聚合反响7、 引物二聚体及发夹构造得能值过高(超过 4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使 PCR 反响不能正常进展8、 对引物得修饰一般就是在 5’端增加酶切位点,应依据下一步试验中要插入PCR 产物得载体得相应序列而确定引物序列应当都就是写成 5-3 方向得, Tm 之间得差异最好掌握在 1 度之内,另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp 左右要设计引物首先要找到 DNA 序列得保守区同时应推测将要扩增得片段单链就是否形成二级构造如这个区域单链能形成二级构造,就要避开它如这一段不能形成二级构造,那就可以在这一区域设计引物① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性② 产物不能形成二级构造③ 引物长度一般在 15~30 碱基之间 ④ G+C 含量在 40%~60%之间 ⑤ 碱基要随机分布 ⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基得互补。

⑦ 引物之间不能有连续 4 个碱基得互补 ⑧ 引物 5′端可以修饰 ⑨ 引物 3′端不行修饰 ⑩ 引物3′端要避开密码子得第 3 位1、引物得特异性 引物与非特异扩增序列得同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源2、避开产物得二级构造区 某些引物无效得主要缘由就是引物重复区 DNA 二级构造得影响,选择扩增片段时最好避开二级构造区域用有关计算机软件可以推测估量mRNA 得稳定二级构造,有助于选择模板试验说明,待扩区域自由能(△G°) 小于 58、6lkJ/mol 时,扩增往往不能成功假设不能避开这一区域时,用 7-deaza-2′- 脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增得成功就是有帮助得3、长度 寡核苷酸引物长度为 15~30bp,一般为 20~27mer引物得有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln 值不能大于 38,由于>38 时,最适延长温度会超过 Taq DNA 聚合酶得最适温度(74℃),不能保证产物得特异性4、G+C 含量 G+C 含量一般为 40%~60%其 Tm 值就是寡核苷酸得解链温度, 即在肯定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链得温度,有效启动温度,一般高于Tm 值 5~10℃。

假设按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)估量引物得 Tm 值,则有效引物得Tm 为 55~80℃,其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最正确5、碱根底随机分布 引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在尤其 3′端不应超过 3 个连续得 G 或 C,因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发6、引物自身 引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状构造牙引物本身复性这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合假设用人工推断,引物自身连续互补碱基不能大于 3bp7、引物之间 两引物之间不应不互补性,尤应避开 3′端得互补重叠以防引物二聚体得形成一对引物间不应多于 4 个连续碱基得同源性或互补性8、引物得 3′端 引物得延长就是从 3′端开头得,不能进展任何修饰3′端也不能有形成任何二级构造可能,除在特别得 PCR(AS-PCR)反响中,引物 3′端不能发生错配 在标准 PCR 反响体系中,用 2U Taq DNA 聚合酶与 800μmol/L dNTP(四种dNTP 各200μmol/L)以质粒(103 拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min 得循环参数扩增 HIV-1 gag 基因区得条件下,引物 3′端错配对扩增产物得影响就是有肯定规律得。

A∶A 错配使产量下降至 1/20,A∶G 与 C∶C 错七下降至 1/100引物 A:模板 G 与引物 G:模板 A 错配对 PCR 影响就是等同得 9、引物得5′端 引物得 5′端限定着 PCR 产物得长度,它对扩增特异性影响不大因此,可以被修饰而不影响扩增得特异性引物 5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合 DNA 序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列与引入一启动子序列等 10、密码子得简并 如扩增编码区域,引物 3′端不要终止于密码子得第 3 位,因密码子得第 3 位易发生简并,会影响扩增特异性与效率Hairpin 发卡构造假设自由能值大于 0 则该构造不稳定从而不会干扰反响假设自由能值小于 0 则该构造可以干扰反响二聚体可以在序列一样得两条引物或正反向引物之间形成假设配对区域在 3末端问题会更为严峻 3 末端配对很简洁引起引物二聚体扩增使Pair Rating 匹配度评分匹配度低得引物对常常不太有效就是由于在同样退火温度下Tm 低得引物打算扩增得特异性而Tm 高得引物更易于形成非特异性结合而造成错误得起始【1】引物得长度以 15－30bp 为宜,否则会影响扩增得特异性。

2】 】碱基尽可能随机分布,避开一样得碱基成串排列,引物得 G+C 含量在 40％－60％之间,假设 G+C 含量太低,可在 5”端加上一些 G 或 C,假设 G＋C 含量太高,可在5”端加上一些 A 或 T3】应避开每条引物内部形成二级构造及两条引物得 3”端互补形成引物二聚体, 避开在引物得 3”端有 3 个 G 或 3 个 C 成串排列,3”端得末位碱基最好选 T、C、G, 而不选 A,也有建议在引物得两端用 1－2 个嘌呤碱基4】 尽可能使用两条引物得 Tm 值一样(最好相差不要超过 5℃),退火温度依据较低得 Tm 值选定,也可以通过转变引物得长度来平衡两条引物得退火温度Tm 值可以依据 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算而对于较长得引物,Tm 值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”得计算方式得到,现有得 PCR 引物设计软件大多数都承受这种方式注:对于 Tm 值得计算有争议得地方就是附加序列应不应当计算在内, 我觉得有值得商讨得地方由于从理论上只有最开头得循环引物得附加序列就是不与模板链结合得,而在后来得 PCR 反响中,引物得附加序列就是与模板链结合了得)【5】 引物得 3’端要与模板严格配对,而 5’端碱基没有严格得限制,只要与模板DNA 结合得局部足够长,其 5’端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态,这样, 我们可以在引物得 5 末端加上酶切位点(引入酶切位点时,要考虑到进展双酶切得共用缓冲液,否则给下游工作带来困难)、启动子,便利下游操作。

6】 不要在扩增序列得二级构造区设计引物,以免退火困难也要考虑引物设计处模板得特异性PCR 引物设计得目得就是为了找到一对适宜得核苷酸片段,使其能有效地扩增模板 DNA 序列因此,引物得优劣直接关系到 PCR 得特异性与成功与否要设计引物首先要找到 DNA 序列得保守区同时应推测将要扩增得片段单链就是否形成二级构造如这个区域单链能形成二级构造 ,就要避开它如这一段不能形成二级构造,那就可以在这一区域设计引物现在可以在这一保守区域里设计一对引物一般引物长度为 15~30 碱基,扩增片段长度为 100~600 碱基对让我们先瞧瞧 P1 引物一般引物序列中 G C 含量一般为 40%~60%而且四种碱基得分布最好随机不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在否则 P1 引物设计得就不合理应重查找区域设计引物同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于 4 个连续碱基得互补引物确定以后,可以对引物进展必要得修饰,例如可以在引物得 5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增得特异性影响不大但 3′端确定不能进展任何修饰,由于引物得延长就是从 3′端开头得这里还需提示得就是 3′端不要终止于密码子得第 3 位,由于密码子第 3 位易发生简并,会影响扩增得特异性与效率。

综上所述我们可以归纳十条 PCR 引物得设计原则:① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性② 产物不能形成二级构造③ 引物长度一般在 15~30 碱基之间④ G C 含量在 40%~60%之间⑤ 碱基要随机分布⑥ 引物自身不能有连续 4 个碱基得互补⑦ 引物之间不能有连续 4 个碱基得互补⑧ 引物 5′端可以修饰⑨ 引物 3′端不行修饰⑩ 引物 3′端要避开密码子得第 3 位PCR 引物设计得目得就是找到一对适宜得核苷酸片段 ,使其能有效地扩增模板DNA 序列如前述,引物得优劣直接关系到 PCR 得特异性与成功与否对引物得设计不行能有一种包罗万象得规章确保 PCR 得成功,但遵循某些原则,则有助于引物得设计1、引物得特异性引物与非特异扩增序列得同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源2、避开产物得二级构造区某些引物无效得主要缘由就是引物重复区 DNA 二级构造得影响,选择扩增片段时最好避开二级构造区域用有关计算机软件可以推测估量 mRNA 得稳定二级构造,有助于选择模板试验说明,待扩区域自由能(△G°)小于 58、6lkJ/mol 时,扩增往往不能成功假设不能避开这一区域时,用 7-deaza-2′-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增得成功就是有帮助得。

3、长度寡核苷酸引物长度为 15~30bp,一般为 20~27mer引物得有效长度:Ln=2(G C) (A T ,Ln 值不能大于 38,由于>38 时,最适延长温度会超过 Taq DNA 聚合酶得最适温度(74℃),不能保证产物得特异性4、G C 含量G C 含量一般为 40%~60%其 Tm 值就是寡核苷酸得解链温度,即在肯定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链得温度,有效启动温度,一般高于 Tm 值 5~10℃假设按公式 Tm=4(G C) 2(A T)估量引物得 Tm 值,则有效引物得Tm 为 55~80℃,其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最正确5、碱根底随机分布引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在尤其 3′端不应超过 3 个连续得 G 或 C。