靶向抑制PI3KAkt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响.doc

靶向抑制PI3K/Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响　　【摘要】目的研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子〔Sa〕基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响方法将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002参加胃癌细胞株SG7901,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖,DNAladder检测细胞凋亡,原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,免疫组织化学检测Sa的表达结果LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关在DNA电泳图上,对照组呈规那么的基因组断裂条带,其亮度与药物作用时间呈正相关流式细胞结果显示LY2940002处理后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,作用12h时,细胞凋亡达58.7%Sa在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达；LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染结论PI3K/Akt信号通路、Sa基因与胃癌细胞的凋亡关系亲密　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞株胃癌细胞系SG7901由本实验室传代培养,含10%小牛血清(美国SIGA公司)的RPI1640培养基,在37℃培养箱中培养,2～3d更换培养基1次　　1.1.2实验试剂Sa多克隆抗体(美国Santaruz公司)；PI3K抑制剂LY294002〔美国Prega公司〕；流式细胞仪〔ulter,EpiusELITE,ESP,美国)。

　　1.2方法　　1.2.1LY294002溶液的配置按照配制说明书先将LY294002干粉5g充分溶解于二甲基亚砜〔diethylsulfxide，DS〕溶液325μL中,配制成50l/L的LY294002溶液,移入-20℃冰箱储存,用前稀释成所需的浓度　　1.2.2四甲基偶氮唑蓝〔TT〕法检测细胞生长活性选择对数生长期细胞,接种于96孔培养板,另设不加细胞的培养液为对照组实验组分别给予终浓度为10,30,50μl/L的LY294002〔DS≤0.05%〕,对照组参加同等浓度的DS,每孔设3个复孔再培养4,8,12h,每孔分别参加5g/L的TT10μL加DS100μL,振荡用酶标仪在波长490n处测每孔光吸收值〔D〕,重复3次计算：细胞存活率〔%〕=D试验组/D对照组×100%　　根据TT结果选择出干预浓度和时间　　1.2.3DNALadder检测搜集各组细胞,用PBS重悬,参加细胞裂解液(1%NP40,20l/LEDTA,50l/LTris)400μL,反响10in,离心搜集上清,参加十二烷基硫酸钠(SDS)至1%浓度,参加RNA酶在56℃作用1h,参加蛋白酶K37℃处理过夜,乙醇沉淀DNA,TE溶解DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并拍照。

　　1.2.4原位细胞凋亡检测技术〔TUNEL〕检测细胞凋亡将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,取对数生长期细胞待细胞长满后,给予终浓度为10,30,50μl/L的LY294002〔DS≤0.05%〕,分别培养4,8,12h后,取出盖玻片,用4%多聚甲醛溶液固定,并与阻断剂室温孵育30inPBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2in滴加TUNEL反响混合溶液50μL,在湿盒中37℃孵育参加转化剂(PD)50μL,在37℃湿盒中孵育30in参加DAB底物溶液50～100μL，封片,在光镜下分析结果：细胞凋亡指数=凋亡细胞数倒置显微镜计数200个细胞　　1.2.5流式细胞仪检测调整待测细胞的密度设置对照组及观察组搜集细胞,70％冷乙醇固定24h,10μg/LRNaseA37℃温育30in后,加碘化丙啶(PI)使其终浓度达20μg/L,暗处作用＞0.5h　　1.2.6胃癌细胞SG7901Sa表达的检测将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,当盖玻片面上的细胞长至70%～80%交融时,参加终浓度为50μl/L的LY294002,不加药物作为对照组,培养4,8,12h,小心取出长有细胞的盖玻片,4℃冷丙醇固定,按试剂说明行SP法免疫组织化学染色,用PBS代替一抗作为阴性对照片。

采用Gatalia等的半定量积分法计算[5]　　2结果　　2.1TT法检测胃癌细胞增殖随着不同浓度LY294002作用时间延长,细胞的存活率呈逐渐下降趋势(P0.05，表1〕　　表1四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率〔略〕　　Tab1ellviabilityfSG7901ellsafterexpsurefLY294002(10～50μl/L)fr4,8,12h　　同一浓度LY294002干预不同时间相比拟,#：P0.01；△：P0.01.　　2.2胃癌细胞凋亡结果　　2.2.1DNALadder结果对照组呈规那么的基因组断裂条带,50μl/L的LY294002作用4,8,12h后,均可见180～200bp的梯型条带,其亮度与药物作用时间呈正相关随着LY294002作用浓度增加,胃癌细胞凋亡增加〔图1〕　　2.2.2TUNEL检测结果50μl/LLY294002作用4,8,12h,细胞的凋亡指数上升,且在同一时间点上,随着干预浓度增加,细胞凋亡指数升高；在同一浓度点上,随着作用时间延长,细胞凋亡指数升高〔表2,图2〕　　图1DNALadder电泳图〔略〕　　Fig1DNALadder　　表2TUNEL法检测细胞凋亡指数〔略〕　　Tab2ellappttiindexfSG7901ellsafterexpsurefLY294002(10～50μl/L)fr4,8,12h　　不同浓度LY294002干预一样时间相比拟，#：P0.01；同一浓度LY294002干预不同时间相比拟，△：P0.01.转贴于论文联盟.ll.　　2.3胃癌细胞增殖周期改变同一浓度LY2940002处理SG7901细胞不同时间,在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,50μl/LLY294002处理8h时,凋亡细胞就达33.7%；12h时,凋亡细胞达58.7%〔图3〕。

　　2.4LY294002对Sa蛋白表达的影响Sa蛋白表达于细胞质内,呈淡黄色或棕黄色分布,在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达(χ2=36.246,P0.05)；经LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染〔表3,图4〕　　表3同一浓度LY294002作用不同时间后Sa蛋白表达变化〔略〕　　Tab3TheexpressinfprtEinSaafterexpsurefLY294002(10～50μl/L)fr4,8,12h　　箭头所指为阳性细胞.A：对照组；B～D：10μl/L作用4,8,12，随作用时间延长，阳性细胞粒增加h；E～G：30μl/L作用4,8,12h，阳性细胞粒与作用时间成正比；H～J：50μl/L作用4,8,12h，作用时间越长，凋亡细胞越多.　　图2TUNEL法检测胃癌细胞凋亡〔略〕　　Fig2TUNELanalysis　　AP：凋亡细胞；A：对照组；B～D：LY29400250μl/L作用4,8,12h.　　图3流式细胞检测不同浓度LY294002干预SG7901细胞凋亡〔略〕　　Fig3Flytetryanalysisabutapptsis　　箭头所指为阳性细胞.A：4h；B：8h；：12h,作用时间延长，细胞质着色增加.　　图4LY294002对Sa蛋白表达的影响(×400)〔略〕　　Fig4TheeffetfLY294002ntheexpressinfprtEInSa(×400)　　3讨论　　3.1PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞通过各种通路所形成的复杂的网络来传递各种增殖和凋亡信号。

其中,PI3K/Akt信号通路在多种人类肿瘤中表达失调,调节肿瘤细胞的增殖和凋亡,并与肿瘤的血管形成和侵袭转移也亲密相关,因此影响患者的预后,同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点PI3K/Akt信号通路在胃肠道肿瘤的发生、开展中起关键作用。