表达乙肝表面抗原在烟草细胞悬浮培养.doc

摘要：乙肝病毒的表面抗原编码的基因被克隆到植物的转化载体pIIERlOO pHBslOO带和不带内质网滞留信号，分别转化的烟草细胞系的转基因的整合， 通过PCR和Southern卬迹杂交进行分析表达水平，用ELISA法测定显示2 LG 乙肝表面抗原克的最高的表达水平鲜重10 ngmL的用过的培养基在转化细胞 pHERlOOo Western印迹分析证实24 kDa条带特定的转化细胞中HBsAg的存在下 乙肝表而抗原表达细胞分泌的形式在PHER100转化的细胞中海集运的HBsAg 来自pHBslOO转化的烟草细胞的浮力密度确定，并发现是1. 095 GMLo HBsAg的 从转化的烟草细胞中得到的类似的来自人血清浮力密度的属性Z—这是由植物 细胞中的HBsAg颗粒的分泌到细胞培养基中的第一次报告病毒性肝炎是最致命的和广泛的传染性疾病，乙肝病焉(HBV)是最值得人 类持续血症据估计，H前约有3. 5亿慢性乙肝病毒携带者，占世界总人口的5%, 并且每年20万新感染病例发生［1］乙肝病毒感染是肝癌的远期后遗症［2］,据 估计，其中75-100万将死于肝癌和/或肝硬化［1］治疗费用昂贵，治愈率并不 令人印彖深刻。

冃前在酵母生产重组疫苗，但在大规模免疫接种计划的发展中国 家酵母來源的疫苗的费用禁止其使用植物细胞提供了一个更便宜的替代其他类 型的细胞，因为他们唯一的要求是营养素，盐，维生素和生长调节剂［3］它们 可以生长在传统的发酵罐，批量小的调整，补料分批，灌注，连续发酵方式他 们已经成功地按比例放大至100000 L ［4］许多重组蛋白已表达的烟草细胞悬 浮培养物，它包括单链可变区片段［5］,工程抗体［6］,促红细胞生成素［7］,人 GM-CSF ［8］,与小鼠单链抗体⑼乙肝表面抗原已经烟草中表达［10］,萬苣,和羽扇豆［11］,和马铃薯［⑵ 来口转基因烟草植株的HBsAg物理，生化，免疫类似酵母來源的rllBsAg ［10, 13］ 最近，香港等［14］报道了成功的小鼠口服免疫与乙肝表面抗原在转基因马铃薯 中表达卡普斯塔等［11］在人类志愿者喂食转基因萬苣植物表达HBsAg特异性 血清IgG反应已经有人颗粒(22纳米)，在植物细胞培养的HBsAg的表达和分 泌没有报告在本研究中，我们报道了 NT-1细胞的烟草及其分泌到细胞培养液 中HBsAg表达据我们所知，这是第一份关于植物细胞分泌到细胞培养液中的 HBsAgo 材料和方法NT-1细胞株的建立得到了博伊斯汤普森植物研究所研究公司，伊萨卡，纽 约，美国。

NT-1 MS盐组成的半固体培养基上保持对愈伤组织进行［15］, 230毫 米2 -乙磺酸(Nmorpholino), KH 2 P0 4 132MM, 55MM肌醇，3莫耳盐酸硫胺 素,10莫耳2,4-D和87. 7mM蔗糖介质的pH值调节至5. 7,卿 0. 2%Phytagel (Sigma)的凝胶化发起的细胞培养物培养于50ii】L液体培养基中相同的组合物 的200毫克的愈伤组织旋回瓶的细胞培养物上生氏在80 -在黑暗的原代培 养和传代一次在10天的每分钟100转进行改造，用4-6天传代培养后的细胞优化，以获得最大的机会增加变量的接种物的细胞的鲜重(即，用于启动的 细胞培养的愈伤组织的量)的范围为0.1〜5克鲜重(FW)的愈伤组织接种量分 别为接种到50毫升的液体NT-1中一式三份的每一个量，并保持在黑暗中，在 100 rpm的转速下旋冋振荡器上培养10天Z后，倍的平均鲜重增加为每个接种 星的数据进行统计学分析乙肝表面抗原的基因，亚克隆到植物转化载体克隆植物转化载体用于建设 pHERlOO 和 pHBslOO 是 pMSI164 ［16］,其中 MSI-99 基因被删除用 BamHl 和 SacI 限制。

乙肝表而抗原的？基因克隆的相应位点，得到的ER滞留信号的编码序列 分别在30端，有和没有植物的转化载体pllERlOO和plIBslOOo引物，用于扩增乙肝表面抗原？基因与ER滞留信号分别为:(1) 50 TACTGGATCC ACCATGGAGAACATCACA 302) 50 AATGTATACC CAGAGACAAAAGAA 303) 50 CGTCCTTCTC GGACATAATGTATACCCAG A 304) 50 TCTAGAGCTC TTACAGCTCGTCCTTCTCG GACAT 305) 50 TCTAGAGCTC TTAAATGTATACCCAGAG ACAAAAGAA 30o用BamHl位位点和Kozak序列［17］的HBsAg ATG密码子上游的引物1的正向 引物引物2, 3和4是重叠的引物作为反向引物，将ER滞留信号和SacI位点 30的HBsAgo作为除了一个终止密码子和SacI位点的引物2引物5是相同的来构造pHERlOO, HBsAg基因扩增HBV基因组DNA克隆到质粒pBR 322 （从 ATCC获得），使用的正向引物和引物2, 3和4分别作为反向引物，引物1,在三 个连续两轮PCR 一个循环的产物作为模板的连续的圆。

这导致在50的 BamH I -Kozak序列的乙肝表而抗原-ER滞留信号Sad位30个片段的产生结扎 后产生的第三轮PCR片段用Smal消化的pBluescript SK +获得PBS她和DNA测 序做是为了确认将ER滞留信号在30 口结束对HBsAg的？的基因pBS中HER, 用BamH I和Sac I限制释放699 bp的DNA片段中HER并克隆到BamllT和SacT 位已消化的PMSI164到生产pHERlOO （图1A）要构建pHBslOO,乙肝表面抗原？基因扩增HBV基因组DNA,通过PCR用引 物1和5由此产生的产品50的BamHl位科扎克序列，乙肝表面抗原SacI位30 结扎用Smal消化的pBlucscript SK + PBS HBs阳性得到的BamHl和SacI酶 切消化pBS中氢键的681 bp的DNA片段，克隆到BamHl和SacI位己消化的 PMSI164到pIIBslOOC图lB）o贿 PCR反应进行50会反应混合物中含有引物（各 100毫微克）,Pfu DNA聚合酶（MBI Fermentas公司，美国）（1.0个单位），200 莫耳每种dNTP, 1? PCR缓冲液，100 ng模板。

PCR反应条件为：初始变性3分 钟，在94 C的后面跟着扩增30个循环，每个循环包括以下步骤：94?下进行1 分钟，55? C,持续1分钟，72°C1分钟，最后的10分钟延长在72? Co农杆菌介导转化农杆菌EHA 105 ［18］,窝藏pHBSlOO和pHERlO0的用于转 化生长活跃的细胞（4-6天postsubculture,红细胞圧积0. 5毫升）共培养 30分钟，用农杆菌生长过夜在YENB培养基中（酵母提取物7. 5 gL的1和营养 肉汤8.0克L? 1; HIMEDIA印度）补充50 IgmL? 1卡那霉素共培养后，细胞 被吸入玻璃纤维过滤器上，转移到NT-1的半固体培养基，并维持3天在黑暗中 经过3天，以及与细胞的过滤器转移到含有头抱嗟月亏（400毫克的L 1）和卡那 霉素（50毫克的L1）的培养基中将转化的细胞选择的卡那霉素100毫克的L 1和发达的愈伤纽织转移到液体NT-1培养基中添加卡那霉素（300毫克的L 1） 启动细胞悬浮培养PCR和Southern blot分析转基因整合的转基因细胞被证实使用分离转化和控制细胞基因组DNA的PCR和 Southern blot分析。

DNA的提取采用CTAB方法,基本上如［19］下面的两个引 物被用来扩增681 bp的DNA片段的HBsAg • S?基因：50LL PCR混合物含有引物（每100毫微克）,Taq DNA聚合酶（1.0 U）,每 种dNTP 200流明,1? PCR缓冲液，100 ng的基因组DNA作为模板o PCR条件为: 94 C初始熔融3分钟，然后35个扩增循环，每次循环包括以卜•步骤：94? C, 持续1分钟，55? C,持续1分钟，72°C1分钟，以最终10分钟延长为72? C将10微克的每个基因组DNA样品用EcoRI消化，在1%琼脂糖凝胶上电泳, 并转移至到 Hybond N + 膜（Amersham 公司，Pharmacia Biotech 公司，英国） 膜Sambrook等人所描述的进行处理［20］对随机引物放射性标记的探针BamHI 位消化PBS她通过随机引物标记方法获得699 bp的DNA片段，这些DNA进行杂 交膜进行杂交，洗涤供应商推荐的通过放射自显影显示结果Western blot 分析20克愈伤组织中提取总可溶性蛋白与20毫升的裂解缓冲液（lOOmM的磷酸 钠，pH值7.4, 100mM的抗坏血酸钠,0.1%的Triton X-100,和2mM苯甲基磺 酰氟），并在磁力搅拌器上孵育过夜，在4 ?（：如前所述［10］。

将得到的溶胞产 物进行离心分离30分钟，并在30000克进一步通过两次离心40分钟40000克， 将上清液澄清然后将270毫克的氯化艳/ niL的澄清的溶胞产物中加入，在 Beckman 70T1转子梯度离心18小时，在55, 000 rpm的转速下的梯度级分收 集并测赵通过ELISA法检测IlBsAg的存在含有IIBsAg的级分汇集起來，沉淀细 胞总蛋门，通过添加甲醇，氯仿和水的比例为3点01分02秒体积和离心3分钟 8000克到较低的中间相，加入2倍体积的甲醇中，并再次离心3分钟将所 得沉淀，空气干燥，溶于400 LL1?样品缓冲液（50讪的Tris-盐酸，pH为6. 8, 10%甘汕，2%SDS, 1%2 -疏基乙醇,0.0025漠酚蓝和100mM二硫苏糖醇）和 上述样品20 LL用于Western E卩迹分析作为一个标准的酵母来源的rHBsAgo 使用兔抗-HBsAg血青（1:1000稀释）作为第一抗体和抗兔IgG HRP结合物（Sigma 公司）作为第二抗体（1:20,000稀释）Amersham公司的ECL试剂盒是用于可视 化的特异性条带Western blot分析进行了描述［20］。

酶联免疫吸附分析总蛋白提取从非转化的对照和转基因细胞系中的表达，如所述［10］超嚴 心步骤后得到的沉淀级分，一式三份测泄为HBsAg的使用AUSZYME试剂盒（住持）, 阳性对照（人血清衍生的HBsAg）作为标准和阴性对照（用于从菲转化细胞中提 取的蛋白质的表达水平）使用了介质从PHER100,是pHBslO0转化的细胞培 养物和非转化的细胞培养物也被测定分泌的HBsAg与上文所述相同的试剂盒 氯化艳密度梯度分析从转化的烟草细胞总蛋口的HBsAg从pIIBslOO转化的烟草细胞中提取和氯化锥密度梯度离心法 进行了如上所述的在Western blot分析收集1毫升懾分从离心管的底部，乙 肝表面抗原通过ELISA使用ShanTest-HBsAg的试剂盒（桑塔生物技术研究所， 卬度）测定级分由梯度级分与HBsAg的总蛋白沉淀，基本上如Western卬迹分 析将所得沉淀空气干燥，溶解于1吗？上样缓冲液，并通过Western blot分 析梯度级分的密度，折光率（尔玛伤害折射仪，东京，日本）测定结果HBsAg的'S'在这项研究中，乙肝表面抗原的基因插入植物转化载体克隆？ 基因克隆到植物表达载体？ ??终端微粒保留的信号（SKDEL）,使用三个反向引 物序列重叠在30日结朿，三轮PCR产生pHERlOOo序列数据的确认30 ER滞留 信号在pHERlOO （数据未示出）的掺入。

pHBslOO构建了没有? ??终端微粒保留 信号发展转基因烟草的细胞株NT-1细胞发展成独特的殖民地电镀后3个星期内。