第五章种子的扩大培养2教学讲义.ppt

第五章第五章 种子的扩大培养种子的扩大培养 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求 种子制备实例种子制备实例 种子制备的技术概要种子制备的技术概要关键词：关键词： 种子，要求，制备，扩大种子，要求，制备，扩大第一节第一节 种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念: : 种种子子扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养, ,最最终终获获得得一一定定数数量和质量的纯种过程这些纯种培养物称为量和质量的纯种过程这些纯种培养物称为种子种子种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长q 无杂菌污染无杂菌污染1、斜面、斜面 (AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%， pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不生长良好，所使用斜面连续传代不超过超过3次次2. 2. 一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）培养条件：培养条件：于于1000 mL三角瓶中，装液三角瓶中，装液200-250 mL，32培培养养12小时。

小时培养基：培养基：葡萄糖葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基已经基本接近于发酵培养基3. 3. 二级种子二级种子( (种子罐种子罐) )培养条件：培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%1%(10%)(10%)），），3232培养培养7-107-10个小时个小时培养基：培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为糖代替，浓度为2.5%2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/mL大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列pH 7.0-7.2 时结束，时结束，6.8 8 7.0-7.2活力旺盛活力旺盛二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安安瓿瓿管管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵1. 斜面孢子斜面孢子培养基：培养基：甘油、甘油、 葡萄糖、葡萄糖、 蛋白胨等蛋白胨等培养基特点：培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天，注意湿度天，注意湿度50%左右左右2. 大米孢子大米孢子培养基：培养基：大米及氮源（玉米浆）大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。

米的白点小）有利于孢子的生长培养条件：培养条件：25、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求：大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4106个孢子个孢子3. 3. 一级种子一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：2727，4040小时小时接种量：接种量：200200亿孢子亿孢子/ /吨吨4. 4. 二级种子二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：2727、10-1410-14小时小时接种量：接种量：10%10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于处于期期青霉素发酵菌丝体的生长共分为青霉素发酵菌丝体的生长共分为6 6个期，个期，1-41-4为为年青期，年青期，4-64-6期合成青霉素的能力最强期合成青霉素的能力最强第三节第三节 种子制备的技术概要种子制备的技术概要一、种子制备的过程一、种子制备的过程实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂该培养过程在菌种室完成，因此形象验室常见设备，在工厂该培养过程在菌种室完成，因此形象地将该培养过程称为地将该培养过程称为实验室阶段的种子培养实验室阶段的种子培养。

生产车间阶段：生产车间阶段：种子培养在种子罐里进行，在工厂归为发酵种子培养在种子罐里进行，在工厂归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段生产车间阶段实验室阶段实验室阶段1. 培养物选择的原则培养物选择的原则目的：目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类点最终的培养物可分为两类A. A. 对于不产孢子和芽孢的微生物对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养 获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐稳定的种子，但操作繁琐B. B. 对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制便于操作，但需要更仔细的控制。

2. 2. 培养基选择的原则培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基孢子培养基应该是有利于孢子的生长应该是有利于孢子的生长 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原培养基的原料一般都比较精细料一般都比较精细3. 3. 起始接种物的传代问题起始接种物的传代问题q 细菌细菌保藏斜面保藏斜面 活化斜面活化斜面q 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面目的：目的：使菌种的传代次数尽可能的少使菌种的传代次数尽可能的少 生产车间阶段生产车间阶段1. 1. 培养物的选择原则培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体q 缩短发酵时间缩短发酵时间q 有利于获得好的发酵结果有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：2. 2. 培养基选择的原则培养基选择的原则目的：目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。

体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富在原料方面：在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: : 一是成本一是成本 二是驯化二是驯化例：例：柠檬酸发酵柠檬酸发酵q 以蔗糖为原以蔗糖为原料料成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 蔗糖蔗糖 2.5-5% 20%NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%琼脂琼脂 2%q 薯干粉薯干粉成分成分 斜面斜面 种子罐种子罐 发酵发酵麦芽汁麦芽汁 麦汁麦汁 薯干粉薯干粉 10% 22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂琼脂 2%3. 3. 发酵级数的确定发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）一级种子（摇瓶）二级种子二级种子 （小罐）（小罐）发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子 （小罐）（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从时，工厂从第一级种子罐第一级种子罐开始计算发酵级数开始计算发酵级数发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q 级数受级数受发酵规模发酵规模、菌体生长特性菌体生长特性、接种量接种量的影响的影响q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般一般2-42-4级。

级q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面的一个方面采用三级种子的谷氨酸发酵工艺采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 李文东，李文东， 发酵科技通讯，发酵科技通讯，2003,7斜面斜面一级种子（一级种子（1200ml/5000ml1200ml/5000ml三角瓶）三角瓶）二级种子二级种子（2m2m3 3）三级种子（三级种子（20m20m3 3)发酵（发酵（240m240m3 3) )背景：背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%1%左右）左右）三级种子大种量（种子罐是发酵罐的三级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%5%以上）以上）文章：文章：三级种子工艺三级种子工艺用途用途用途用途成分（成分（成分（成分（%）规模规模规模规模保藏保藏保藏保藏牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏 （英国）（英国）（英国）（英国） 1 1 1 1，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）脂粉（日本）脂粉（日本）脂粉（日本）1.81.81.81.8， 无机盐无机盐无机盐无机盐斜面斜面斜面斜面添加添加添加添加 0.10.10.10.1的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上的口服葡萄糖，其余同上一级一级一级一级口服葡萄糖口服葡萄糖口服葡萄糖口服葡萄糖 3 3 3 3， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 2.42.42.42.4，尿素，尿素，尿素，尿素 0.650.650.650.65，无，无，无，无机盐等机盐等机盐等机盐等1200 ml 1200 ml 1200 ml 1200 ml /5000 ml/5000 ml/5000 ml/5000 ml二级二级二级二级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 2.02.02.02.0， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 2.0 2.0 2.0 2.0 ，甘蔗糖，甘蔗糖，甘蔗糖，甘蔗糖蜜蜜蜜蜜 1.0, 1.0, 1.0, 1.0, 尿素尿素尿素尿素 0.350.350.350.35， 无机盐等无机盐等无机盐等无机盐等1.2 / 2 m31.2 / 2 m31.2 / 2 m31.2 / 2 m3三级三级三级三级玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖玉米淀粉双酶糖 4.04.04.04.0， 玉米浆玉米浆玉米浆玉米浆 1.5 1.5 1.5 1.5 ，甘蔗糖，甘蔗糖，甘蔗糖，甘蔗糖蜜蜜蜜蜜 1.0, 1.0, 1.0, 1.0, 液氨，复合维生素液氨，复合维生素液氨，复合维生素液氨，复合维生素 01 mg/L01 mg/L01 m。