水产动物病原检测技术的发展现状.pdf

综 述 水产动物病原检测技术的发展现状 水产业 自2 0 世纪 5 0年代起就 开始从捕捞业向养殖业的转变 ，水 产养殖业是农业经济的主要支柱产 业 随着养殖规模 的不断扩大 ，水 产养殖病害的发生日益频繁，危害 也越来越严 重 ，是制约 整个水产 养 殖业发展的最重要的因素之一 ，做 好病害的预防工作是养殖业的重中 之重为了对各种暴发病 、流行病 进行深入研究和监控 ，将现代生物 技术应用于各种病原诊断和防治 ， 建立灵敏 、准确 、快速的病原检测 技术已迫在眉睫 常规水产病害检测技术主要包 括目捡、镜检 、解剖检查、病原的 分离鉴定等方法当前 ，用于捡测 水产动物病毒、细菌性病害的现代 生物学技术发展迅速 ，主要包括分 子生物学、免疫学 、细胞培养方法 等三 大方 面 ，这 些技 术发 展迅 速 ， 且在原有基础上根据实际的需求产 生出很多相应的衍生技术，已被广 泛应用于多种水产动物病毒性 、细 菌性 、寄生虫等病害的诊断，在水 产动物病害诊断中并发挥着巨大的 作用 1核酸检测技 术在水产 病 害诊断中的应用 王 艺 红 ( 漳州市水产技 术推广站) 1 1聚 合酶 链 反应( PCR)技 术 聚 合 酶 链 反 应( P o l y me r a s e C h a i n Re a c t i o n ，P C R) ，又称无细 胞克隆技术 ( F r e e B a c t e ri a C l o n i n g T e c h n i q u e ) ，是一 种根 据生 物体 内 D NA复制的某 些特 点而设计 的， 在体外对特定 D NA序列进行快速 扩增的技术。

待检病原具有某一特 定基因 片段 时 ，即可利用特 异性 的 引物对 样 品中微 量 的 目标 D NA进 行 P C R 扩增 ，增加 靶 D NA数量 ， 使其达到足够的检测量，通过电泳 检测扩增出的特定片断，即可确定 感染的病原 P C R检测技术具有灵敏性高 、 特异性强、可靠迅速等特点，在水 产养殖动物处于带菌状态或大规模 爆发细菌性疾病之前能进行快速 、 准确的检测，这是传统方法无法比 拟的目前国内外已建立了不少用 P C R技术检测水产病原菌的方法： 邓 先余 等 建 立 了 副 溶血 性 弧 菌 1 6 S～2 3 S r D NA 基 因 间 区 序 列 ( 1 6 S～2 3 S i n t e r g e n i c s p a c e r r e — g i o n s ，I G S s )的 P CR技术；Ma k i — n o 等已经完成副溶血弧菌的基因组 测序，从而使副溶血弧菌毒力基因 及特异 的基因序列得到进 一步确 定 ，根据 副溶血弧菌特异基因序 列 ，设计 引物 ，进行 P C R 检测 ， 是现阶段检测副溶血弧菌的最快速 准确的方法；L e e 等采用了 P C R技 术对 创伤弧菌进行 鉴定 ；J o n ~i k C h u n等利 用 1 6 S ～2 3 S r RNA基 因 间 区 序 列( 1 6 S～ 2 3 S i n t e r g e n i c s p a c e r r e g i o n s ，I G S s )的保 守 性 ， 建立了鉴定拟态弧菌的 P C R技术 ； A r a k a w a 等 1 9 9 0年等应用 P C R技 术检 测了虹鳟鱼传染性 造血器官坏 死 病毒( I n f e c t i o u s Ha e ma t o p o i e t i c Ne c r o s i s V i r u s ，I HN V) ，并以生物 素标记的寡核苷酸探针鉴定了产物 的特异性 ；祝瑕琳等选择针对溶藻 弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因， 哈 维氏弧菌的部分 T o x R基因的特异 性， 优化 设计 了 3 对特异性引物 ，建 立了一种检测大黄鱼致病性弧菌的 多重 p C R检测方法。

同时，在病原菌检测的实际工 作中进行了大量的改进下，开发出 免疫 P C R ( I m mu n o - P C R) 、套式 引物 P C R ( Ne s t e d p ri me r P C R) 、 反转录 P C R ( Re v e r s e t r a n s c r i p t i o n P C R) 、实 时荧光 P C R ( Re a l t i me fl u o r e s c e n P C R)等新类型的 P C R 技术 ，克服常规 P C R技术存在一 定的假阳性 、灵敏度低等缺点 4 9 综 述 1 ． 2核酸杂交技术 核酸杂交技术已成为多种水产 动物疾病的常规诊断方法按杂交 的方式可分为斑点杂交 、S o u t h e rn 转移杂交 、原位杂交等 ，根据酸分 子探针的来源和性质可分为基因组 DNA探针 、c DN A探针 、RNA探 针及人 工合成 的寡聚合苷酸探 针 等核酸杂交检测方法已经在多种 病原检测中应用 ：De e r i n g等 1 9 9 1 年研制了生物素标记的反意义探针 检测染性 造血器官坏死病毒 ( I H— N V ) ，该探针特异性好 ，只能与 I — HN V反应并且可以识别所有的 I — HN V毒株 ，能快速检测被 I HNV 感染虹鳟 、硬头鳟 、银鳟和几种大 马哈鱼及大西洋鲑 ；C u n n i n g h a m等 使用 D I G标记的 DN A探针来检测 大 西 洋 鲑 鱼 三 代 虫 病( G y r o d a c — t y l o s i s s o f A t l a n t i c S a l mo n ) ，根据 反应信号可鉴定唇齿鲥三代虫 、德 氏三代虫和鳟三代虫。

· 1 ． 3聚合酶链反应与分子杂 交 联用技术 早期的斑点杂交法所用核酸探 针制备过程较繁琐 ，耗时长 ，且如 果回收的克隆片断不纯 ，可能存在 非特 异性 标 记 如 果把 P C R 和 斑 点杂交技术结合起来，就可以克服 上述弊端，通过 P C R 反应可快速 、 大量的合成特异性探针( 此探针可以 直接用于样品病原 DNA检测 ，也 可以用于样品病原 DN A经 P C R扩 增后的产物检测) ，闰冬春等建立了 P C R一核酸探针斑点杂交检测痕量 白斑综合症病毒 WS S V的方法；杨 冰等利用非放射性标记物地高辛 ， 通过 P C R方法制备了对虾传染性 皮下及造血组织坏死病 ( I HHN V) DNA探针 ，通过核酸斑点杂交检 测法对 I H HNV进行检测 通过斑 点杂交可进行大批量的样品检测 ， 操作简便 、安全，易于推广 ，并且 灵敏度比单纯 的 P C R法或斑点杂 交法有进一步的提高 另外 ，原位 P C R检测方法也 已用于多种水产动物病毒的检测 ， 原 位 P C R 是 指在 细 胞或 细 胞 切 片 上对 待 测 的 低 拷 贝数 基 因进 行 扩 增，并通过原位杂交进行检测。

这 种方法不仅能够检测出病原菌的存 在 ，且能够将 其在组织细胞 中定 位 ，因而具有其他 P C R方法所不 能比拟 的优越性 T a n g K F J 等运 用原位 P C R在凡纳滨对虾 中检测 出能引起机体肌肉坏死的对虾诺达 病毒 1 ． 4限制性酶切技术 限制性酶切技术是指限制性酶 消化产物在电泳图谱或 S o u t h e m杂 交中产生的一系列带纹，不同带纹 代表了在染色体不同位置上不同长 度的 D NA序列目前在病原微生物 检测上应用的限制性酶切技术主要 包括限制片段长度多态性( Re s t r i c - t i o n fra g m e n t l e ng t h p o l y mo r p h i s m ， RF L P ) 、随机扩 增 的多态性 DNA ( Ra n d o m a mp fi fi e d p o l y mo r p h i c DN A， R AP D)和扩增片段长度多态 性( A mp fi fi e d ff a g me n t l e n g t h p o l y — mo r p h i s m， A F L P ) 。

早 在1 9 9 6年 ， L e e z J 等在 对水 产 上 引起 多种鱼 病的双 RNA病毒进行基因组差异 分析时 ，就应用 RF L P技术 ，对编 码 V P 2蛋白的一段 c D NA进行酶切 分析 ，为不同地区水产双 RNA病 毒的分类提供依据；孔杰等已将限 制性酶切技术应用于对虾病毒的鉴 别 1 ． 5 1 6 S r RNA技术 由于细 菌种 间 1 6 S r RNA基 因 序列间隔区在长度 、序列上具有相 对 多变性 ，所 以利用保 守区基 因作 为 引物 ，对 间 隔 区进 行 克 隆 和 分 析 ，就能为病原微生物的各菌株 、 种、属的鉴定 、分型提供依据 该 检测技术 目前已被成功的运用到了 病原菌的种、属以及家族种类的鉴 定 中 ，彭 宣宪 等 2 0 0 0年 采 用细 菌 1 6 S r RN A基因保守区特异性引物 ， 建立了鉴定嗜水气单胞菌、鲁克氏 耶 尔 森 菌 、鳗 弧 菌 、柱 状 曲挠 杆 菌 、乙型链球菌 、荧光假单胞菌等 病原菌的 UP P C R技术；邹玉霞等 通 过对 大 菱 鲆 出 血 症病 原 菌 的 1 6 S r RN A基 因进行 系统发 育学分 析 ，确定了该病原菌为鳗弧菌。

孔 杰等用 1 6 S r RN A基因的内切酶 图 谱快速鉴别对虾病原菌 1 ． 6基因芯片技术 基 因芯 片又 称 D NA芯 片 ，是 专门用于核酸检测的生物芯片，也 是目前运用最广泛的微阵列芯片 近年来，水产病害相关领域的成果 和互联 网生物信 息公 共资源 的迅速 增加，使基因芯片在我国水产动物 病毒诊断领域的应用基础已经完全 具备 刘荭采用基因芯片技术原 理 ，达到了在一个载体上同时检测 2 个样品和 l 2 种水生动物病毒的目 的 1 ． 7 DNA测 序 DNA测序是指对特定基因全 序列的测定一般是用于对上述各 种方法的进一步确认 ，而这种确认 往往是 不必要 的 ，所 以只 是在上述 方法出现模棱两可的情况时，才考 虑 DNA测序进行确认 2免疫 学 检测 技 术 在水 产病害诊断中的应用 2 ． 1 血清学检测技术 血清学检测技术建 立在抗原抗 体反应的基础上，其中单克隆抗体 技术是 K o h l e r 和 Mi s t e i n于 1 9 7 5年 发展起来的利用杂交瘤细胞制备大 量针对某一抗原决定簇的特异性抗 体的技术已有人采用多克隆抗体 技术结合酶联免疫技术成功的检测 对虾 WS S V；利用此技术制备了抗 鳗弧菌的单克隆抗体和抗嗜水单胞 菌外毒素的单克隆抗体；陈琼等利 用该技术制备的单克隆抗体提纯嗜 水气单胞 菌 h e c 毒素 。

2 ． 2 酶联免疫检测技术 利用了免疫 反应( 即抗原一抗 体 反应) 的高度特异性和酶促反应的高 度敏感性 ，对抗原或抗 体进行检 测，是一种定性和定量的综合性技 术在水产动物病原检测中主要有 酶联 免疫吸附 技术( E L I S A法 )和 免疫酶斑点技术 ( D o t — E L I S A法) E L I S A法在水产养殖病原体诊断尤 其在鱼病学诊断上应用较广 ，国内 如钱冬等用该法检测细菌性败血症 病原—嗜水气单胞菌；国外则较早 用 E L I S A法对疖疮病、红嘴病 、细 菌性肾脏病和爱德华氏菌病等鱼类 疾病进行快速诊断陈怀青等应用 D o t - E L I S A法检测鱼类致病性嗜水 气单胞菌 h e c 毒 素 ；马家 好 、李 学 勤。