神经元原代培养.pdf

神经元原代培养一、准备 1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水对照瓶内插入1～2 支温度计 (保证测试温度的准确性)将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时 30 分钟灭活后分装，10ml/瓶， 一瓶放在培养箱做无菌实验， 其余-20～-70℃保存2）D-Hank’s 液(g/L) ：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红： 0.02，超纯水溶解，调节PH 至 7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心） 3）多聚赖氨酸： 避光，用超纯水配制好后过滤，200μ l 或 400μ l/tube 分装, -20度储存母液浓度为 5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自 Sigma，P2636，100mg） 配置方法： 20ml 超纯水溶解，分装为1ml/管用时加入49ml 超纯水稀释为 0.1mg/ml 的工作液4）50mM 谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μ l/tube，-20℃保存。

使用时需将终浓度调整为25μ M（购自 Sigma，G8415，100g，分子量： 147.13） 配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g， 即 0.01mol=10mmol， 溶于 200ml 超纯水中，配制为 50mM 的谷氨酸母液例：500ml 的 Neurobasal Medium 中加入 Glutamate 母液（ 50mM）250μl，此时终浓度约为 25μM 5）胰蛋白酶： 0.25%（购自 Hyclone，SH30042.01，100ml） 6）阿糖胞苷（AraC）母液： 10mM，(阿糖胞苷， 1：1000稀释用 )（购自 Sigma，C1768，100mg，分子量： 243.22） ；配制方法： 100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml 超纯水溶解，配制成10mM 的 AraC 母液AraC 工作液： 10μM （半量换液，终浓度5μM ） ；7） DNAse I （SIGMA Cat. No. D5025 or Roche Cat.NO 4536282001, 2*10000U ） （购自 ROCHE，10104159001 ，100mg，1mg=2000U，用 dH2O 配成 10mg/ml 母液，过滤分装 100μ l/tube，每次使用 50-100μ l）8）培养基FBS DMEM/F12：购自 Hyclone，SH30023.01B，500ml 双抗：购自 GIBCO，151400122 ，100ml Neurobasal Medium-A： 购自 GIBCO， 10888022(新生鼠 )或 21103049 （孕鼠） ， 500ml B27：购自 GIBCO，17504-044，10ml Glutamax-100X：购自 GIBCO，3505061，100ml ① 分离培养基：10%FBS+DMEM/F12+双抗② 培养用 Start Medium：Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25μM③ 换液用 Culture Medium：Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax 100X 5ml 2. 耗材 1）EMS 盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。

2）各型枪头： 10μ l、100μ l、1000μ l、5ml 3）细胞培养皿： 4）细胞培养瓶： 5）离心管：二、步骤1. 手术器械消毒：直头眼科剪、直头、弯头显微镊各1 把为一套器械，准备两套并分别置于 50ml 烧瓶中， 70%酒精浸泡 30min2. 动物：出生 24小时内的 SD 大鼠（下称乳鼠）约10 只；3. 海马组织分离：①培养皿 2 个，分别加入冰冻D-Hank ’s液约 5ml，至于冰盘上；②取乳鼠， 用左手拇指和食指固定乳鼠头部，酒精棉球皮肤消毒3 遍，直头眼科剪酒精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤，换第二把直头眼科剪剪开颅骨，弯头显微镊向两侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑，换第二把弯头显微镊由颅底部分离乳鼠大脑，然后置入冰冻的D-Hank ’s液中③用直头显微镊固定乳鼠大脑， 将两大脑半球分离后， 用弯头显微镊分离脑干后，以直头显微镊固定并敞开皮质， 最后用弯头显微镊由海马游离端仔细分离海马组织，并剔除血管及脑膜④将分离好的海马组织至于加有冰冻D-Hank ’s 液的青霉素瓶中，用直头眼科剪剪碎组织至约1mm3的小块，加入约5 倍组织体积的0.25%胰蛋白酶 37℃消化10min，加入分离培养基终止消化。

⑤机械吹打分散细胞， 40μm 筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心 6min，弃去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成4× 105个/ml的单细胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内⑥在通以 95%空气、5%CO2，37℃ 细胞培养箱中培养 接种72h后，加入含10μM阿糖胞苷的 Culture Medium作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖之后每隔两天用Culture Medium换液，每次更换的量为原体积的1/2，培养12天后对神经元进行鉴定并用于实验换液举例： 1 月 1 日培养神经元，于1 月 4 日用含 AraC（10μM ）的 Culture Medium 换液，AraC 作用 48小时后（ 1 月 6 日）用 Culture Medium 换液，最后一次于 1 月 9 日换液此为一般情况，视具体情况而定，应于换液前在显微镜下观察，看是否污染、胶质细胞多少、 神经元状态，胶质细胞较多时可延长AraC作用时间，污染和神经元状态不好应丢弃，若需延长培养时间可以加换一次液体。