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不同培养条件对苏棉12茎尖组织培养的影响摘要将苏棉12无菌种子放于不同的培养基上培养5~7天成 苗，然后制备茎尖分别放在不同的激素和不同添加物的培养基上 培养，探索出适合茎尖生长成苗的一套比较完整的体系结果是 无菌苗生长的最佳培养基为1/2MSB+30g/L葡萄糖+8g/L琼脂+活 性炭，茎尖在MSB+30g/L葡萄糖+0.1mg/LIBA+1.0g/L活性炭+ 2.2g/L植物凝胶的培养基上生长迅速成苗率高最后选取培养基 上生长良好健壮的苗，通过嫁接提高再生植株的定植成活率并有 效地缩短缓苗时间，克服了棉花再生植株不易定植成活的困难， 为棉花遗传改良奠定了基础关键词：苏棉12茎尖植物凝胶引 言 棉花是世界上最重要的经济作物，我国是世界上主要产棉 国家之一，自上世纪五十年代我国十分重视棉花育种工作，不断的培 育出来适合我国栽培的品种，尤其是七十年代开始以基因工程方法 培育棉花新品种，目前棉花转基因方法主要有农杆菌介导法、基因 枪法和花粉管通道法人们已如采用花粉管通道法等技术，将苏云 金杆菌Bt杀虫基因导入棉花品种，培育出了8七转基因抗虫棉，还采 用生理育种、杂交育种等方式获得很多优良品种。

棉花遗传转化植株再生困难、基因型依赖性强、转化周期长及效率 低是目前制约棉花遗传转化的主要因素，而茎尖培养在种质资源保 存、特异材料扩繁和杂种优势固定中起着十分重要的作用［1棉花顶 端分生组织可不通过愈伤组织的脱分化和不定器官的分化而直接获南京晓庄学院第五届“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 得再生植株，并且茎尖分生组织培养植株再生不受基因型的限制， 所以棉花茎尖培养作为棉花生物技术的基础研究方法其重要地位是 显而易见的研究利用棉花茎尖外植体作为转基因受体，可以避免 用原生质体、愈伤组织等作基因受体时所遇到的植株再生频率低， 再生植株后代易发生变异等障碍⑵，有利于棉花遗传转化利用这一 点我们可以建立茎尖分生组织和遗传转化结合的遗传转化体系棉 花茎尖分生组织是一群具有分生能力的细胞，能很快分化生长，再 生成完整植株探讨茎尖分生组织培养植株的再生条件，激素的种类和浓度是 组织培养中影响较大的因素，丁世萍等人⑴指出，适合棉花茎尖培养 的最佳激素和浓度为0.01-0.1mg/LIBA （吲哚丁酸），在使用糖源中 葡萄糖明显好于蔗糖，陆地棉在供试品种中没有表现出明显的差异 本实验做采用了植物凝胶作为凝固剂，研究出一系列最佳培养因素 的组合，看能否缩短棉花的培养周期提高成活率，这样就为保存难 于繁殖和保存的棉属野生种以及农杆菌介导转化改变棉花的性状这 些研究缩短了周期，并且提高了成功的可能性。

苏棉12号（原系号 太193）于1983年-1990年采用杂交选育方法培育得到⑶，本实验研 究苏棉12茎尖在不同条件下茎尖的生长情况，采用活性碳吸附棉花 的次生代谢物，采用植物凝胶作为固化剂，探索出最适合茎尖生长 的培养基，建立更适于茎尖生长的培养体系，为棉花改良奠定基础1实验材料和试剂苏棉12号种子植物激素植物凝胶活性炭等2实验方法2.1无菌种子的获得用75%的乙醇进行消毒苏棉12号种子表面，即将种子放入75% 乙醇中震荡1min，用无菌水冲洗3-4遍，然后用20%的双氧水浸泡 2h，再用无菌水冲洗3-4遍，最后加足量的无菌水，使得种子完全 浸在水中，浸泡24h24h后要换水，确保种子能获得足量的氧，水 不必没过种子⑷2.2无菌苗培养基的选择及无菌苗的获得待无菌种子露白时即可将种皮剥去，接种到1/2MSB培养基上， 放到避光的28^的培养箱中培养3-5天，等到苗长出两片叶子但没 完全展开时再放到光下培养，待到其苗变绿1/2MSB培养基有三种： MS1（1/2MSB+30g/L 葡萄糖+脱脂棉）， MS2（1/2MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂），MS3（1/2MSB+30g/L葡萄糖+8g/L琼脂+活性炭），选用自来水质⑷，比较三种培养基上苗长的情况，选出最佳培养基。

2.3影响茎尖的生长因素的试验将上述培养的无菌苗取出，用镊子小心弃除两片子叶，取带有 茎尖的下胚轴大约2cm,然后用刀沿轴中线将茎尖一分为二留下约 0.5cm长的带有茎尖的下胚轴（尽量少保留与分生组织相连的下胚 轴），将之转接到不同激素种类极其配比的MS培养基中，各接6瓶, 光照条件下培养，每天见光14h,光强均2000LX左右，培养温度25 土2笆，大概20天左右统计生长情况，并确定最佳生长浓度2.3.1不同碳源对茎尖生长的影响蔗糖是二糖，而葡萄糖是单糖，许多组培实验是用蔗糖作为糖 源，但是棉花是木本植物，其次生代谢产物较多，影响其吸收功能，所以可以实验比较蔗糖和葡萄糖对其生长的影响S1 （MSB+10g/L 蔗糖+8g/L 琼脂），S2（MSB+20g/L 蔗糖+8g/L 琼脂），S3（MSB+30g/L 蔗糖+8g/L 琼脂），G1（MSB+10g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂），G2（MSB+20g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂），G3（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂）观察并记录不同培养基上茎尖生长情况的差异2.3.2不同的封口方式对茎尖生长的影响选择用硫酸纸和保鲜膜封口，观察不同的封口条件对苗生长的影响 情况。

2.3.3不同激素对茎尖生长的影响激素是影响体细胞胚发育的关键因素[1],不同激素对茎尖生长的 影响也各不相同，本实验选取IAA+KT的组合和IBA等激素按照一定 的浓度配培养基，配方如下：加IAA的培养基为：A0（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IAA0mg/L+KT0.1mg/L），A1（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IAA0.1mg/L+KT0.1mg/L），A2（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IAA0.5mg/L+KT0.1mg/L），A3（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IAA1.0 mg/L+KT0.1 mg/L ），A4（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IAA2.0 mg/L+KT0.1 mg/L） 观察并记录茎尖在这五种培养基上的生长情况加IBA的培养基为：B0 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IBA0 mg/L）, B1 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IBA0.05mg/L）, B2 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IBA0.1mg/L）, B3 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IBA0.5 mg/L）, B4 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+IBA1.0mg/L）。

观察并记录茎尖生长情况2.3.4不同浓度的活性炭对茎尖生长的影响由于棉花是木本植物,有大量次生代谢产物，因此前面的培养过 程中基部部均出现褐化的现象，所以需要改变外植体的生长环境，这 里用活性炭进行吸附，研究其对棉花茎尖再生的影响.将切好的茎尖 转到下面几种浓度的活性炭的培养基中培养各接8瓶在光照条件 下培养，每天见光14h，光强均2000LX左右，培养温度25±2°C，大概 20天左右，统计生长情况确定哪种活性炭浓度吸收次生代谢产物效 果更好，更加有利于茎尖培养成再生植株T0.1C（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+0.5g/L 活性炭）， T0.2C（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂 +1.0g/L 活性炭）， T0.4C（MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+2.0g/L 活性炭） 观察并记录茎尖在不同浓度活性炭培养基上生长情况2.3.5不同浓度卡那霉素（Kam）对茎尖生长的影响在棉花的转基因过程中，有些是不成功的，所以会影响以后的研究, 而卡那霉素能够对未转成功的棉花茎尖具有一个很好的致死效果， 但是致死效果最佳的kam的最低浓度需要确定，以达到最经济最有效 的效果。

加入Kam的培养基分别为：Kn1 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+50 mg/LKam）,Kn2 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+60mg/LKam）,Kn3 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂+80 mg/L Kam）, Kn4 （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂 +100 mg/L Kam） 观察并记录不同培养基上茎尖生长情况2.3.6琼脂和植物凝胶对茎尖生长的影响培养基配方为：P （MSB+30g/L葡萄糖+2.2 g/L植物凝胶），A （MSB+30g/L 葡萄糖+8g/L 琼脂）观察不同培养基上茎尖生长的差异2.3.7最佳培养基上的生长情况将茎尖接到MSB+最佳激素+最佳碳源+最佳活性炭浓度+最佳固化剂， 选择最好的封口方式，放到组织培养室培养，待到其成苗以后嫁接 到花盆里的棉花苗上，以提高成苗率2.4嫁接、成苗将成活的茎尖嫁接到花盆里的棉花苗上，使得无菌苗成苗在装有培养土的土盆中，种上苏棉12号的种子，温室25°C照光14h条件下培养，每天浇水,如果苗长得不好则有1/2MSB配成培养液 浇之，待苗长生长一个月左右，有1〜3片真叶即可作嫁接之用.选约5cm高并具1〜3片真叶的再生植株的顶芽作接穗,用锋利 刀片削去砧木的顶端部分，只保留子叶和1〜2片真叶，将茎杆从中 间纵向剖开（1cm左右），插入削成扁平状的接穗，用细绳系紧并用 Parafilm石蜡膜缠裹。

整个植株用透光性好的塑料袋或地膜罩盖保 湿，前7 d应避免阳光直射7 d后去除石蜡膜和细绳，10 d后除去罩盖，置于温室下使其正常生长3.实验结果与分析3.1不同培养基对无菌苗生长的影响虽然MS1配起来很方便，但无菌苗在其上生长相当瘦弱，茎太 细，很不利于操作，而且茎尖的成活率很低o MS2上生长的苗长势一 般，但茎也不是很粗壮，而且明显可以看到根部有杂质产生，影响 茎对营养的吸收MS3上生长很好，苗的茎较粗壮，比较容易进行下 一步的操作因此，选用MS3作为无菌苗的培养基，继续进行下一 步实验3.2不同因素对茎尖生长的影响3.2.1不同碳源对茎尖生长影响的结果分析糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一迄今为止，已用 于植物组织培养的糖类有50多种在植物体细胞组织培养中,蔗糖一 直作为标准碳源，然而其他糖类物质如：葡萄糖、麦芽糖和山梨醇对 植物体细胞培养也产生了一定的影响［4-6］蔗糖是二糖，而葡萄糖是 单糖，许多组培实验是用蔗糖作为糖源，但是棉花是木本植物，其 次生代谢产物较多，影响其吸收功能，所以可以实验比较蔗糖和葡 萄糖对其生长的影响本实验分别选取蔗糖和葡萄糖作为碳源，蔗 糖和葡萄糖每升培养基中分别加入10g，20g和30go实验结果发现：加入不同量的糖茎尖的生长情况不同，加入 30g/L时茎尖生长较好，而且加入蔗糖的培养基上的茎尖有明显的褐 化现象，且茎尖生长到2片叶子以后生长点就不再伸长，但是加入 30g/L的葡萄糖的培养基上的苗比加入蔗糖同量的培养基上的生长 的好，能够正常生长。

所以选择30g/L的葡萄糖作为碳源附图版1 S3上生长的茎尖）3.2.2不同的封口方式对茎尖生长的影响植物的生长也是需要空气的，生长过程中组织培养瓶中的空气要是 能够与外界充分交换就更有利于植物组织的生长，有利于茎尖的成 苗本实验选用硫酸纸和保鲜膜封口作对比，保鲜膜价格便宜而且 操作方便，不容易染菌，而用硫酸纸比用保鲜膜麻烦实验结果显 示：采用同样的培养基，用保鲜膜封口的茎尖长势缓慢，而用硫酸 纸封口的茎尖长势好因此，还是选用硫酸纸封口3.2.3不同激素对茎尖成苗情况激素种类和含量的不同在茎尖分生组织成苗中的作用也有别在不 加激素的培养基上，培养2个。