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乳酸菌超氧化物歧化酶基因的克隆与特性分析[11-02-14 11:28:00 ]编辑：studa20作者：王小英，马文丽，郑文岭【摘要】 目的：克隆乳酸菌超氧化物歧化酶(SOD)基因并进行特性分析方法：根据已报道的乳酸菌SOD基因序列，采用PCR技术获得SOD碱基序列，将所 得的PCR产物插入克隆载体pMD 18T中，重组质粒经酶切，PCR鉴定及测序，获得的序列进行生物信息学分析结果：成功克隆了 SOD基因，序列分析表 明，该SOD基因由621 bp组成，编码206个氨基酸残基，蛋白分子量为23 KD，等电点为4.96结论：该蛋白氨基酸序列主要以a 螺旋为主关键词】 乳酸菌;超氧化物歧化酶;基因克隆［ABSTRACT］ Objective: To clone and make characteristic analysis of superoxide dismutase (SOD) in lactic acid bacteria. Methods: Based on reported genetic sequence of SOD in lactic acid bacteria, obtained base sequence of SOD by PCR. Inserted product of PCR into cloning vector pMD 18T, and made enzyme digestion of recombinant plasmid. Implemented PCR identification and sequencing, and made bioinformatics analysis of sequence. Results: SOD gene was successfully cloned. Sequence analysis indicated the gene was 621 bp, encoding 206 amino acid residues, with the protein molecular weight as 23 KD and isoelectric point as 4.96. Conclusion: The main sequence of protein animo acid is alpha helix.［KEY WORDS］ Lactic acid; Superoxide dismutase; Gene cloning超氧化物歧化酶(简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶 类，是生物化内超氧化物阴离子的清除剂，它能使有氧代谢产物：O2歧化为 O2和H2O2,从而清除O2 对生物体的毒性。

自1969年首次被McCord和 Fridovich从牛血红细胞中发现和分离提取以来［1］，由于SOD在抗氧化、抗肿 瘤、抗衰老以及对抗细胞细胞凋亡［2 5］等方面起着重要作用，在医药、食品、保健品、化妆品等行业中具有广阔的应用前景目前SOD大多是从天然动 植物中提取，但是，提取法由于天然原料含量极微、提取工艺复杂等原因导致 制品纯度低，产量少为解决来源的限制问题，寻找比较经济的途径是必要 的利用微生物特别是基因工程微生物制取SOD的研究日益受到关注［6,7］乳酸菌是一类重要的工业微生物，乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值， 改善食品风味，增加食品保藏期和附加值，而且具有特殊生理活性和营养功 能乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，具有降低血清胆 固醇、抗肿瘤、抗衰老和免疫赋活作用［8,9］研究证实，乳酸菌具有不同的抗 氧化活性，乳酸菌的无细胞提取物具有清除机体羟自由基、过氧化氢的能力[10,11]虽然乳酸菌的抗氧化活性已得到了证实，但它在体内的作用机制还不 是很清楚，关于它的作用机制和抗氧化活性有关的物质需要进一步的研究关 于乳酸菌抗氧化性的研究越来越多地受到食品科学、预防医学等许多学科学者 的广泛重视。

本研究中，乳酸菌SOD基因的克隆及生物信息学分析将为乳酸菌 抗氧化性的进一步研究及用基因工程方法大批量生产SOD奠定基础1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒乳酸乳球菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心； 大肠杆菌DH5a由本室保存;pMD18T购买于北京天根生化科技有限公司1.1.2试剂材料 细菌培养试剂购于Sigma公司；LA DNA聚合酶、T4连接 酶购自大连宝生物公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒 提取试剂盒、DNA Ladder购自北京天根生化科技有限公司1.2 方法1.2.1乳酸乳球菌基因组DNA的提取用灭菌双蒸水溶解干冻管里的乳酸乳 球菌，并划平板到MRS固体培养基，37 °C培养72 h,挑取单个菌落于MRS液 体培养基于37 C摇床进行增菌利用天根生化科技有限公司细菌基因组提取 试剂盒提取乳酸乳球菌基因组DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度1.2.2引物设计与合成 所用引物根据GenBank中乳酸乳球菌超氧化物歧化 酶基因(SOD)碱基序列(GenBank序列号：GeneID:1114019)设计P1： 5' CGC GGATCC GCG ATGGCATTTACATTA 3'P2： 5' CCG CTCGAG CGG TTATTTTGCTTTAGCAT 3'上述引物由上海Sangon生物工程技术服务有限公司合成(下划线碱基分别 为BamHI和Xho I酶切位点)。

1.2.3超氧化物歧化酶SOD基因的PCR扩增与鉴定 反应总体积为25 p L：模板 DNA(1 p g/p L) 3 p L，10Xbuffer 2.5 p L,Mg2+( 25 mM)2.0 p L, dNTP(2.5 mM)2.0 p L,引物 P1(10 pmol/p L) 0.5 p L,引物 P2 (10 pmol/p L)0.5 p L,LA DNA 聚合酶(5 U/uL)0.15 p L,双蒸水 14.85 p L;反应条 件：95 C，5 min;95 C,1 min;55 C,1 min;72 C,1 min; 30 个循 环;72 C，7 min1%的琼脂糖凝胶电泳检测1.2.4超氧化物歧化酶SOD基因的克隆与鉴定PCR扩增出目的基因，1%琼 脂糖电泳，切胶后用DNA胶回收试剂盒进行回收，得到的PCR纯化产物与 PMD18T进行连接，转入新制备的感受态大肠杆菌DH5a，再涂布于含氨苄青霉 素的LB培养基上37 C培养过夜，用接种针分别挑取其中的5个菌落于含氨苄 青霉素的LB液体培养基上增菌培养采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液 提取质粒采用双酶切(BamH I和XhoI)和PCR的方法分别对重组子1、2、3进 行鉴定。

经鉴定的阳性重组质粒送北京天根生化科技有限公司测序1.2.5超氧化物歧化酶SOD基因序列的生物信息学分析利用生物软件 ProtParam对所克隆的蛋白质进行物理和化学变量分析利用分析软件 SOPMA、HNN对其进行二级结构进行分析并利用分析软件Blast在NCBI 数据库中进行同源性搜索，选取与乳酸菌SOD同源性较高的链球菌科12种SOD 氨基酸序列，用clusalX1.8程序进行多序列比对，并用MEGA4构建系统进化 树。