荧光物质知识点.pdf

对寡核苷酸的5'或 3'末端进行氨基修饰后，其末端附带的一级脂肪胺可连接氨基反应分子氨基修饰的寡核苷酸也可用于固定目的寡核苷酸在微阵列基质上生物素标记的寡核苷酸作为探针，用于 Southern印记杂交或染色体原位杂交及随后的显色检测也可以用包被链霉亲和素（Streptavidin）的磁珠来捕获带有生物素探针的杂交核酸，用于限制酶切作图、基因组步移与差异显示Cy3 和 Cy5 是新的荧光分子， 具有较好的光稳定性、 高水溶性和高荧光效率它们的激发光谱和发射光谱峰值分别为548/562nm与 646/664nmCy3 和 Cy5 的分子结构和分子量都非常相似，但两者之间的光谱却分得很开，因此，Cy3 和 Cy5 常被用于很多双色实验中，如被广泛应用于基因芯片和蛋白质芯片领域当 Dabcyl 在空间上邻近荧光基团时，可以吸收能量使荧光淬灭，因此它在分子信标，分子淬灭探针中等得到广泛应用羧基荧光素（ Carboxyfluorescein） ，是荧光素衍生物的一种，5-FAM 较 6-FAM 更经常使用与FITC 相比， FAM 与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC 结合蛋白的量更大且进程更易于控制。

FAM适 用 于Argon-ion Laser 的488mm光 谱 线 ，Abs/Em=492/518nm (pH=9.0)，具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定六氯荧光素 （Hexachloro Fluorescein） ，是荧光素衍射物的一种适用于 Argon-ion Laser 激发光源， Abs/Em=535/556nm次黄嘌呤可与C、A、T、G 稳定地配对含有I 的寡聚核苷酸已广泛用作杂交探针，以筛选 cDNA 和基因组文库， 从而获得仅知部分氨基酸编码序列蛋白的编码基因也可以成功地从复杂的 cDNA 和基因组文库中克隆到许多基因磷酸化修饰的寡核苷酸一般被用于定点突变和接头插入与荧光素具有光淬灭率高、pH 敏感性强的缺点相比较而言，TAMRA具有更好的光稳定性，而且在pH4~10 之间， TAMRA的光谱不会受到影响TAMRA偶联物的荧光产率均为荧光素偶联物的1/4，然而TAMRA 易于被 mercuryarc lamps的 546nm 光谱线所激发，且比荧光素具有更好的光稳定性，因此，TAMRA 偶联物常常显示出比相应的荧光素偶联物更强的荧光TAMRA也可以被Green He-Ne Laser 的 543nm 光谱线有效激发，广泛用于分析仪器。

TAMRA 标记的寡聚核苷酸也常用于定量与实时定量PCR、 DNA测序等四氯荧光素（ Tetrachloro Fluorescein）是荧光素衍射物的一种 TET 以及 HEX 均是在 FAM 基础上加以改进的，氯原子使FAM 的 Abs 与 Em 值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了 pH 敏感性 TET 也适用于Argon-ion Laser 激发光源，Abs/Em=521/536nm5'端巯基修饰的寡核苷酸用于连接巯基反应分子，其巯基部分被偶联上荧光基团后，也可以用于DNA 测序和杂交缩 写全 称吸收波长吸收波长颜色Cy3 Indodicarbocyanine 552 570 红色Cy5 Indodicarbocyanine 643 667 紫罗兰6-FAM 6-carboxy-fluorescein 492 518 绿色Fluorescein Fluorescein 494 525 绿色HEX 5-hexachloro- fluorescein 535 556 粉红色TAMRA Tetramethyl-6-carboxyrhodamine 565 580 玫瑰红TET 5-tetrachloro- fluorescein 521 536 橙色TaqMan 探针是一种20~40bp 的寡核苷酸探针，它是一段5’端标记报告荧光基团(R)，3’端标记淬灭荧光基团(Q)的寡核苷酸，其序列与模板DNA 中的某一段完全互补。

报告荧光基团(R)如 FAM、 TET、 VIC 、 JOE、 HEX， 淬灭荧光基团 (Q)为 TAMRA 3’末端一般用PO4、NH2 或封闭碱基予以封闭，以防在扩增时作为引物延伸 当探针单独存在或与与目标序列配对时，由于荧光共振能量转移的发生，R 的荧光受到Q 的猝灭当PCR 扩增时，Taq酶的 5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使探针的 5’端的 R 被切断，加大了与Q 的距离而使荧光恢复，并使荧光监测系统接收到荧光信号随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，从而实现实时定量（Real-Time）检测TaqMan 定量的优点：特异性好： 由于 TaqMan定量使用杂交对定量分子进行甄别，具有很高的准确性 同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好，假阳性低灵敏度高： 荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术，因此 TaqMan 检测的灵敏度很高线性关系好： 由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量操作简单：自动化程度高、防污染使用TaqMan 定量扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染同时扩增和检测一步完成，操作简单，易于实现自动化。

分子信标是一种可形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针在茎环结构中，环一般为15~30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5~7 个核苷酸长， 由 GC 含量较高且与靶序列无关的互补序列构成荧光基团连接在茎臂的一端， 而淬灭剂连接于另一端在此结构中， 荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET） 当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合， 使分子信标的茎杆区被拉开此时 R 荧光不能被淬灭， 可检测到荧光， 从而实现了对目的基因的 定 性 及 定 量 检 测 常 用 的 荧 光 - 淬 灭 分 子 对 有Coumarin-DABCYL、 EADNS-DABCYL、 FAM-DABCYL、TET-DABCYL 、TAMRA-DABCYL、TexasRed-DABYCL 等建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor 、Sunrise、Amplisensor、Scorpion 等。