精品细菌内毒素检验操作程序.doc

山 东 天 力 药 业 有 限 公 司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243-B页码：1/9制定人：审核人： 批准人： 颁发部门：日期：日期：日期：生效日期：分发部门：品质部、中心化验室、过程分析室目的：规范细菌内毒素检验操作程序；范畴：适用于细菌内毒素检查操作；责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施；内容1预备工作1.1试验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时；1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平；1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管1.2内毒素标准品与试验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原就上购进一个批号测定一次；1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）；1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品；1.2.4 75%乙醇、铬酸洗液；1.3试验用具的消毒处理：凡是参加试验样品或试剂接触的器具，在试验前必需经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟；1.4恒温水浴箱内水浴温度调剂到371℃；2鲎试剂灵敏度复核2.1依据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟；2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的内毒素标准溶液，备用；精品.山 东 天 力 药 业 有 限 公 司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：2/9例：工作标准品为160 EU/ml时160EU/ ml标准品溶液0.2ml16EU/ ml0.5ml8EU/ ml0.5ml1.8ml0.2ml1.4ml1EU/ ml0.9ml0.9ml0.5EU/ ml0.9ml0.9ml0.25EU/ ml0.9ml0.9ml0.125EU/ ml0.9ml0.9ml0.06EU/ ml 留意：每稀释一步均应在混合器上混匀30秒；2.3取18支0.25 EU/ml鲎试剂，每支中加入0.1mlBET 水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最终2支加入0.1mlBET 水作阴性对比；2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃1℃水浴锅中，保温602分钟；放入水浴前把水搅动几下，以使水温匀称；再次检查温度是否在所要求的范畴，留意保温顺取放过程应防止受到振动造成的假阴性结果；2.5保温终止后将试管轻轻取出，慢慢转到180，如关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性；（留意：保温盒拿取试管过程应防止受到震惊而造成的假阴性结果）2.6 结果判定当最大浓度2λ4支管均为阳性，最低浓度0.25λ4支管均为阴性，阴性对比2支管为阴性，试验方有效；如图1精品.山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：3/9按下述公式运算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc；λc=antilg〔Σx/4〕当λc在0.5λ-2λ时，方可用于细菌内毒素的检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度；式中：X为反应终点浓度的对数值lg；反应重点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最终一个呈阳性结果的浓度；antilg是lg函数的反函数，在excel里可以用power公式，power（数值）2.7举例设待复核鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml，即λ=0.25 EU/ml；试验结果如下：内毒素浓度 （EU/ml） 0.50 0.25 0.125 0.062 Nc 反应终点浓度X 1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125精品.山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：4/9就：λc =antilg〔∑X/4〕=antilg[（lg0.25＋lg0.50＋lg0.125＋lg0.125）/4]= antilg[〔-0.602-0.301-0.903-0.903〕/4]= antilg〔-0.508〕=0.310（EU/ml）λc在0.5λ-2λ范畴内，符合规定；结果不是内毒素最大浓度（2λ）4管全部阳性，最小浓度（0.25λ）4管全部阴性，本批鲎试剂不能使用；需查找缘由，可能是灵敏度标示不精确或内毒素效价标示不精确，或操作不当所致；3.干扰试验干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法供应依据；3.1制备内毒素标准对比溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ；3.2制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预试验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将11.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液；3.3鲎试剂的预备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内；每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，防止产愤怒泡；如待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到1075mm凝集管中，要求至少分装36管备用；精品.3.4凝胶反应山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：5/9将预备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）；其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准对比液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对比；将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）；其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的含供试品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对比，如表1所示；加样终止后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，防止产愤怒泡，两同试管架放入37℃1℃水浴或相宜恒温器中，保温602分钟后，观看并记录结果；表l 凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液——————2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D无/检查用水——————2注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对比系列；D为阴性对比；精品.山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：6/93.5判定并运算C和B的反应终点浓度的集合平均值〔Es和Et〕 只有当溶液A 和阴性对比溶液D 的全部平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范畴内时，试验方为有效；按下式运算系列溶液C 和B 的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et 〕 :Es= antilg （∑Xs / 4 〕Et=antilg （∑Xt / 4 〕式中Xs、Xt分别为系列溶液C 和溶液B 的反应终点浓度的对数值（lg）；当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～ 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用；如供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验；可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他相宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰；为确保所挑选的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验；当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺转变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验；3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验4.1要求：在细菌内毒素检查中，每批供试品必需做2支供试品和2支供试品阳性对比，同时每次试验必需做2支阳性对比和2支阴性对比； 4.1.1因《药典》对甘露醇原料药内毒素无要求，参照甘露醇注射液内毒素限值，每1g甘露醇中含内毒素的量应小于1.25EU；依据MVD=CL/λ ，且当供试品为注射用原料药时，MVD取1；故20%甘露醇注射液的鲎试剂限度为： λ=0.2g/ml1.25EU/g=0.25EU/ml精品.4.2操作方法4.2.1供试品溶液的制备山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243- B页码：7/9精确称取0.2甘露醇用1mlBET水溶解，制成20%甘露醇溶液；依据MVD=CL/λ，将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD；式中：C为供试品浓度；L为供试品的细菌内毒素限值；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度；例：①当用标示值为0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%1.25/0.25=1〔倍〕,所以把供试品制成20%的稀释液即可；②当用标示值为0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%1.25/0.125=2〔倍〕,所以把供试品制成10%的稀释液即可；③当用标示值为0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD=CL/λ=20%1.25/0.06=4〔倍〕,所以把供试品制成5%的稀释液即可；4.3阳性对比溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液；取规格为10EU的细菌内毒素标准品一支 用酒精棉球将瓶颈消毒后开启，加BET检查用水1.0ml混合15分钟后备用；例：当用标示值为0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂时，2λ=0.5EU/ml， 10EU/ ml标准品溶液0.2ml〔10。