基于Aβ25—35诱导的PC12细胞损伤模型研究定志小丸治疗阿尔兹海默病的作用机制及配伍机制.docx

基于Aβ25—35诱导的PC12细胞损伤模型研究定志小丸治疗阿尔兹海默病的作用机制及配伍机制 摘要利用β-淀粉样蛋白片段Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型，从细胞凋亡及氧化应激两个通路研究定志小丸对Aβ25-35引起的PC12神经细胞损伤的保护作用，并将定志小丸拆方为单味药及三味药，用以说明定志小丸治疗阿尔兹海默病的作用机制、配伍机制以及主要活性药味通过MTT和乳酸脱氢酶含量测定评估定志小丸及各味药对PC12细胞活力的影响，其中人参、茯苓效果最好，与模型组相比，可使细胞活力提高约30%通过细胞凋亡、线粒体膜电位〔MMP〕、丙二醛〔MDA〕及复原型谷胱甘肽〔GSH〕含量测定，进一步从细胞凋亡及氧化应激两个通路研究定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导PC12细胞保护作用，研究结果说明，人参、茯苓效果最优，不仅可以显著抑制细胞凋亡，还可降低丙二醛〔MDA〕含量，减少膜脂过氧化；远志、石菖蒲可以通过提高细胞内复原型谷胱甘肽〔GSH〕含量进而抑制氧化应激损伤，且与人参、茯苓配伍后，可促进主要成分发挥药效，显著提高人参、茯苓的药效人参、茯苓是定志小丸中的主要活性药味，远志、石菖蒲起辅助增强药效的作用。

关键词定志小丸；拆方；配伍作用；Aβ25-35；PC12细胞；细胞凋亡；氧化应激1引言阿尔茨海默病〔AD〕是一种以认知能力丧失为特征的神经退行性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变以及语言障碍由于缺乏有效的治疗药物，使得AD对患者及其家人都是一种消灭性的疾病【1】目前，AD的发病机制仍不十清楚确，β-淀粉样蛋白〔Aβ〕沉积形成老年斑后，诱导神经元氧化应激导致神经细胞损伤甚至死亡，进而导致认知功能进行性退化，是目前公认的主要发病机制之一[2，3]因此，大量研究致力于筛选抗氧化剂和抗凋亡药物作为潜在的AD治疗药物[4～9]中药复方虽然成分复杂，但可以通过多成分作用于疾病相关的多个靶点而发挥协同治疗作用，效果好且副作用较少，这与现代药物集中单一靶点治疗疾病不同越来越多的学者致力于研究中药对于AD的预防以及治疗作用[4，10～15]定志小丸〔DZXW〕，源于唐代孙思邈的?备急千金要方?，由人参〔GR〕、茯苓〔P〕、远志〔PR〕和石菖蒲〔ATR〕四味药按照质量比3∶3∶2∶2的比例组成，人参为“君药〞，茯苓为“臣药〞，远志和石菖蒲为“佐药〞，已在临床上应用多年，主要用于治疗抑郁症、焦虑症、神经衰弱、阿尔茨海默病及帕金森病等病症[16～18]。

之前的研究已经确定了定志小丸中的64种主要活性成分，包括人参皂苷、三萜类化合物、远志皂苷、寡糖酯、蔗糖酯、山酮糖苷等[19]在药理学研究方面，目前大局部研究都集中于人参、远志单味药或某一种有效成分对于AD的治疗作用[20～23]，定志小丸的作用机制及配伍机制尚不明确[24]为了评价药物对AD的潜在治疗效果，目前已建立了多种细胞模型用以研究药物对神经细胞的保护作用，常用细胞模型有研究脑源性神经营养因子作用所使用的转染SH-SY5Y细胞系[10，25～27]，以及研究Aβ蛋白沉积导致细胞毒性和神经元损伤所使用的Aβ诱导的PC12细胞损伤模型[3，15，20，21，28，29]，其中Aβ诱导的PC12损伤模型是目前应用最为广泛的AD治疗药物体外活性评价模型Aβ聚集后可以通过氧化应激、细胞凋亡等多种机制造成AD患者神经元大量丧失和突触损伤[30]，在AD的发病过程中起关键作用大量研究通过考察PC12细胞在Aβ蛋白介导下的氧化应激及细胞凋亡通路的变化考察药物对AD的治疗效果，如通过参加花青素可以显著提高PC12细胞抗氧化应激能力【7】，参加淫羊藿素后可以抑制细胞凋亡、减少LDH泄露及线粒体膜电位的降低[31]。

本研究使用Aβ蛋白诱导的PC12细胞损伤模型研究定志小丸对神经细胞损伤的保护作用，选择Aβ蛋白中毒性最强的Aβ25-35活性片段[32]考察了定志小丸在細胞凋亡和氧化应激两种机制下对PC12细胞的保护作用，其中细胞凋亡通路主要通过MTT实验、LDH漏出量测定、流式细胞仪检测细胞凋亡〔ANNEXINV-FITC/PI双染色法及线粒体膜电位〕等方面进行检测；氧化应激通路主要检测与氧化应激反应密切相关的抗氧化剂复原型谷胱甘肽〔GSH〕及膜脂过氧化的重要产物丙二醛〔MDA〕的含量变化为了说明定志小丸的作用机制、配伍机制及主要活性药味，除定志小丸外，还将其拆方成单味药GR、P、PR、ATR及三味药GR+P+PR、GR+P+ATR、GR+PR+ATR、P+PR+ATR，通过比较在细胞凋亡及氧化应激通路上对PC12细胞的保护作用的差异，说明方法参考文献[33]，取50g的定志小丸用75%乙醇回流提取2次，每次提取时间为2h，提取液为生药量的8倍合并两次提取液，过滤、减压浓缩至50mL，得到定志小丸质量浓度即生药量为1g/mL的提取液拆方后的单药和三味药的提取方法与定志小丸提取方法相同2.3Aβ25-35老化处理参照文献[34]的方法，将Aβ25-35用高压灭菌PBS〔KH2PO4-NaHPO4，10mmol/L，pH=7.2〕缓冲盐溶液配制成浓度为1mmol/L的溶液，37℃孵育72h，使用时用高压灭菌PBS缓冲盐溶液稀释为20μmol/L[35]。

2.4PC12细胞培养及MTT检测细胞活力PC12细胞培养于含10%〔V/V〕胎牛血清〔FBS〕的DMEM高糖培养基中，并参加1%青霉素-链霉素溶液在含有5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养隔天换液，2～3天传代，取对数生长期的细胞用于实验使用MTT法检测细胞活力，实验分4组：空白组、对照组、Aβ25-35模型组及Aβ25-35和中药提取液共同作用组将PC12细胞以4103/孔的密度种于96孔板上，培养24h后，共同作用组将培养基替换为100μL含10%FBS的DMEM培养基溶解的不同浓度的中药提取物溶液，继续培养24h，其它3组更换新鲜培养液继续培养24h随后参加Aβ25-35诱导损伤24h，其中对照组只更换培养液，不参加Aβ25-35弃去培养液，参加100μL1mg/mLMTT孵育4h后，去除MTT溶液，并参加150μLDMSO振荡10min使用酶标仪检测570nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率〔Survivalrate，SR〕2.5ANNEXINV-FITC/PI检测细胞凋亡PC12细胞接种于6孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，收集各组细胞，使用冰PBS清洗两次使用试剂盒内缓冲盐悬浮细胞，300g离心10min，再用缓冲盐重悬细胞，将细胞稀释至1106个/mL。

每管参加100μL细胞及5μLAnnexinV-FITC，室温下避光混匀10min后，再参加5μLPI室温避光孵育5min参加PBS至500μL，轻轻摇匀，孔径75μm〔200目〕尼龙网过滤，使用流式细胞仪检测：FITC：激发波长488nm，发射波长530nm；PI：激发波长535nm，发射波长615nm2.6线粒体膜电位〔MMP〕检测将PC12细胞接种于6孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，收集各组细胞〔约1106个/mL〕，使用预热的PBS缓冲液洗涤两次，将罗丹明123参加至细胞悬液37℃下孵育30min，粒径75μm〔200目〕尼龙网过滤后，使用流式细胞仪分析，激发波长488nm，发射波长530nm2.7乳酸脱氢酶〔LDH〕含量测定使用LDH测定试剂盒，通过受损细胞释放到培养液中的LDH定量测定PC12细胞的损伤经药物和Aβ25-35处理后，收集各组细胞培养上清液，根据试剂盒测定方法处理样品，使用酶标仪测定450nm吸光度值，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，高速离心后，使用BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度2.8复原型谷胱甘肽〔GSH〕含量测定将细胞接种于96孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，用冰PBS清洗2次，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，高速离心后，使用BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度，GSH含量用试剂盒测定。

2.9丙二醛〔MDA〕含量测定将PC12细胞接种于6孔板，干预结束后使用冰PBS清洗2次，使用RIPA裂解细胞，离心取上清液，先进行蛋白定量分析，使用MDA试剂盒测定MDA含量2.10统计学分析实验数据经SPSS18.0软件进行统计分析，所有数据以均数〔x〕标准差异3结果与讨论3.1定志小丸、拆方后单药、三味药及Aβ25-35对PC12的细胞毒性由表1可知，生药量为1mg/mL的9种中药提取物作用于PC12细胞48h后，细胞活力与对照组并没有显著性差异，在此浓度下，药物对于细胞并无毒性，因此选取1mg/mL生药量作为后续实验的加药浓度3.2定志小丸及拆方后单药、三味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞毒性的抑制作用图1所示，与对照组相比，模型组Aβ25-35诱导的PC12细胞的活力明显下降，说明20μmol/LAβ25-35对PC12细胞有明显的毒性，参加1mg/mL的不同中药提取物后，PC12细胞活力显著增加，其中人参、茯苓效果最为明显3.3定志小丸及拆方后的各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC可与磷脂酰丝氨酸〔Phasphatidylserine，PS〕特异性结合。

在细胞凋亡早期，细胞膜失去对称性，PS暴露于细胞膜外，可被AnnexinV-FITC结合，从而成为识别细胞凋亡的标志但是坏死细胞的PS同样外路露于细胞膜外，因此参加碘化吡啶〔PI〕以区分坏死细胞凋亡早期细胞膜仍保持完整性，PI不能进入细胞内，而处于凋亡晚期和坏死的细胞可同时被AnnexinV-FITC/PI著色，可以准确反映凋亡过程流式细胞仪AnnexinV-FITC双染法检测结果显示，PC12细胞在培养或处理过程中有自发凋亡的现象，但凋亡率较低〔图2A〕，经20μmol/LAβ25-35处理24h后，凋亡细胞显著增加，凋亡率到达71.4%〔图2B〕经单味药人参、茯苓〔图2C、D〕处理后，细胞凋亡率显著降低，说明观察细胞凋亡的形态学变化采用ANNEXINV-FITC/PI双染色法研究细胞凋亡变化和细胞损伤该方法可将早、中、晚期及死细胞区分开来正常的活细胞，ANNEXINV-FITC和PI均为低染，不着色；细胞凋亡早期，ANNEXINV-FITC高染，细胞膜呈现绿色荧光，PI低染，细胞核不着色；细胞凋亡中、晚期，ANNEXINV-FITC和PI均高染，细胞膜呈现绿色荧光，细胞核呈现紅色荧光[36]。

如图3所示，通过激光共聚焦显微镜观察，对照组〔图3A〕所选区域无明显细胞异常且无凋亡细胞，模型组〔图3B〕中PC12细胞显示出核聚集，细胞突起回缩，PI染色发出红色荧光经定志小丸提取物处理后的细胞〔图3C-3K〕其细胞凋亡发生了显著的改善其中，经人参、茯苓和定志小丸处理过的细胞变化尤为明显，无凋亡晚期细胞，且细胞形态与健康细胞并无明显差异3.5定志小丸及各味药抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞线粒体膜电位的下降线粒体膜电位〔MMP〕在启动线粒体介导的凋亡途径中起关键作用MMP降低是细胞凋亡早期的重要特征之一[37]如图4A所示，与对照组相比，参加Aβ25-35作用24h后，MMP显著降低，PC12细胞经中药提取物处理后再参加20μmol/LAβ25-35作用24h，MMP均有显著升高说明定志小丸及拆方后的各味药均能抑制Aβ25-35带来的MMP降低，其中人参、茯苓单味药效果最为显著3.6定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞中LDH释放的影响当PC12细胞处于氧化应激状态下时，细胞处于易损状态，LDH漏出率会明显增加[38]LDH水平越高，说明其细胞损伤越严重如图4B所示，模型组LDH漏出率高出对照组70%，经定志小丸及拆方后各味药保护后，均可以显著抑制LDH漏出，其中人参、茯苓单味药效果最好，抑制漏出率可达40%以上。

3.7定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞内MDA含量的影响MDA是膜脂过氧化的重要。