1997牛奶蛋白糖化作用的一个指标结合羟甲基糠醛的色谱测定法.docx

牛奶蛋白糖基化作用的一个指标结合羟甲基糠醛的色谱测定法摘要：5 -(羟甲基)-2 -糠醛(HMF)是在牛奶或其类似系统加热处理时通过美拉 德反应产生的，即通过产生葡糖胺化合物，或是通过异构化和后续糖降解反应传统 意义上讲，HMF已经被用作这两条降解路线的一项指标一种新的分析方法已经形 成，即测定仅通过葡糖胺反应产物的酸降解产生的HMF,被称作结合羟甲基糠醛， 且它可能与热处理或长期储存食品所引起的美拉德反应的程度有关我们已对酸性消 化过程的最佳工艺条件进行了测定反相高效液相色谱法适用于精确测量结合HMF关键词：羟甲基糠醛；牛奶；美拉德反应；高效液相色谱分析简介：乳糖的相对较高浓度以及牛奶中的赖氨酸含量丰富的蛋白质，使其对热致非酶褐 变反应相当敏感在美拉德反应的初始阶段，必需蛋白质-结合赖氨酸的氨基与乳糖 的醛基的反应产生葡糖胺反应产物，乳果糖基赖氨酸(半乳糖-果糖-赖氨酸，不适用 于生物) (O'Brien and Morrisey, 1989)在酸性条件下，乳果糖基赖氨酸的氨基被质子 化，1,2-烯醇经3-脱氧osulose(3-DG)产生5 -(羟甲基)-2 -糠醛(HMF)此外，乳 糖酸催化降解产生HMF也可由3-脱氧osulose获得(Feather, 1970)。

此为糖溶液加 热时产生HMF的两条主要路径：通过美拉德反应中的葡糖胺反应产物经由烯醇化(在 存在氨基的情况下)产生，或是通过被称为洛布雷•德•布律一埃肯施泰因转变的乳糖 的异构化和分解产生 (Ames, 1992).美拉德反应是一个诸多食品加工和储存过程中所发生的复杂的反应网络几种方 法已被用于测定其反应程度，如2 -硫代巴比妥酸(TBA)法，高碘酸氧化法，硼氢 化物还原法，以及咲喃素和羧甲基赖氨酸测定法(Furth, 1988)TBA法已在奶牛场中 得到了广泛的应用 Keeney 和 Bassette (1959)开发了用 TBA 的反应产物(用草酸水解 后所得)测定奶制品中HMF含量的分光光度法自那时起，许多工作表现为将HMF 作为牛奶制品或其他食品的热处理指标的应用该方法的主要缺点是 TBA 对 HMF 缺 乏特异性，因为其他醛类物质也可能参与反应且有色络合物的稳定性有限 (Morales 等,1996).最近，反相高效液相色谱法得到了应用，因为HMF在280nm处有较高的摩 尔消光系数 (van Boekel 和 Zia-Ur-Rehman, 1987; Morales 等, 1992).Morales 等(1996) 比较了测定 HMF 的色谱法和比色法，发现用比色法测得的 HMF 含量的 71.6%是由于 干扰所得的。

因此， TBA 法并非测定 HMF 的可靠方法，尽管它仍被用作一种快速、 廉价的奶类制品热负荷的测定方法此项研究是在一个展览计划中由欧共体支持的其总体目标是了解影响风味、色 泽、营养质量和热加工过程中经历美拉德反应的所有食品的毒理学安全性的因素及其 相互关系，并且通过工艺优化使其得到更好的控制在此基础上，发展可替代蛋白质 糖基化分析的分析方法是一项重要任务结合 HMF 的测定方法已用于非酶糖化的蛋白质在营养、医药和食品科技等不同领域的测定其中一个目标是发展快速测定由乳果糖基赖氨酸（美拉德反应中的葡糖胺 反应产物）降解产生的结合HMF的作为间接评价牛奶蛋白质中美拉德反应程度的方 法，以避免传统方法中所发生的乳糖降解所带来的干扰这是一个确定测定结合HMF过程中最佳操作条件的初步研究材料与方法：样本和热处理酪蛋白酸钠（喷雾干燥，蛋白含量92%）是从系统生物产业（巴 萨罗那，西班牙）获得的模拟牛奶的溶液是用3%的酪蛋白酸钠和5%的乳糖水合 物（或葡萄糖）溶解在磷酸盐缓冲液（10mM, pH6.65）中制得的消毒（直接UHT） 的脱脂牛奶（总蛋白含量2.98%，乳糖含量4.8%, pH6.62）置于带塞测试管中沸水 浴加热3小时（样品SM-I）和5小时（样品SM-II）。

用冰水浴冷却样品并分析样 品亦置于不锈钢紧塞试管（长度、直径分别为120x7mm）中进行油浴,温度为110°C和 120°C，时间长达60分钟制备无糖试样使用Pharmacia （乌普萨拉,瑞典）所描述的NAP-10 （Sephadex G-25） 一次性柱（1.3x2.6cm）的标准流程柱子中加入15mL蒸馏水之后，300微升（10mg 蛋白质）混合良好的牛奶与700微升蒸馏水装入柱子的顶部，同时丢弃洗脱液通过 1.5mL蒸馏水，洗脱液在室温下回收至试管中以供后续分析（T.Henle博士，德国慕尼 黑技术大学，个人通讯）蛋白质回收率为90%糖的测定乳糖，葡萄糖和半乳糖通过离子交换高效液相色谱法进行了分析样 品（1.5毫升）用3.5毫升0.5 M的高氯酸溶液沉淀蛋白质样品置于室温下5分钟后， 在10000转条件下离心5分钟，上清液通过0.45微摩醋酸质滤光片（13毫米，微星 公司，Westboro ，MA）过滤20微升样品在50C条件下注入离子-300高分子树脂 柱（300x7.8mm，互动实验室，加利福尼亚州圣何塞市）硫酸溶液（每升含0.22mL 浓硫酸），被用作0.4毫升/分钟的洗脱液。

糖类物质由折光检测器（尔玛公司，日本 东京）记录HMF测定采用略加修改的Morales等（1992）的反相高效液相色潽法，1mL牛 奶（总HMF，即T-HMF）或去乳糖牛奶（结合HMF，即B-HMF） 100C条件下用 0.5 mL 0.3 N （或其他浓度，0.25-1.0N）的草酸溶液消化1小时在冰中迅速降温后， 混合物用0.5mL三氯乙酸（TCA）溶液（40%, w/v）去除蛋白质，并在10000转离心12 分钟用0.45微米过滤器过滤后，样品用高效液相色谱法分析为测定样品中自由 HMF的含量，跳过酸消化步骤准备脱气流动相时加入0.08M醋酸钠缓冲液，并用 醋酸调节PH至3.6在室温下使用Spherisorb ODS-2 S5分析柱（25x 0.40cm，示踪分 析，巴塞罗那，西班牙）总HMF分析时注射量为20yL，而结合和自由HMF分析时 注射量为40yL选择280nm （0.1 AUFS灵敏度和0.5 s响应时间）进行检测使用 Kontron仪器（意大利米兰）色谱系统总蛋白含量的测定根据Bradford （1976）的蛋白质染料结合方法测定蛋白质的浓度， 使用的试剂是商业化制备（Bio-Rad公司实验室，大力士，CA）的。

标准曲线（每mL蛋白质含2-25腿）由脱脂牛奶和酪蛋白酸钠溶液制得，二者均用凯氏分析法 （IDF,1986）进行检测统计分析所有样品至少一式两份进行分析数据分析使用 Student's test applyingStatgraphic plus v. 1.0 software （Statistical Graphics Corp., Rockwille, MD）来进行结果与讨论由于乳糖在反应介质中的存在，HMF作为美拉德反应的具体指标的 应用受到了限制样品在沸腾的酸液中进行酸消化促进了 HMF由其前体物质通过两 条途径：（a）经由1,2 -烯醇发生的葡糖胺化合物（主要是乳果糖基赖氨酸）降解和（b）酸催化的乳糖降解（Feather and Harris, 1973; Anet, 1964）的形成HMF本身是酸 不稳定性的，尽管超过80%的结合蛋白放射性标记葡萄糖在最佳反应条件下可被释放 为HMF,但在实践中这一产率通常小于10 （Yaylayan和Huyghes-Despointes，1994） 进一步说，Berg和van Boekel （1984）发现，在低于130°C的条件下，牛奶中发生的乳 糖异构化及后续降解反应在数量上比美拉德反应更占优势。

30冷口SE)暑禺Water added {mL)图1 300mL新鲜脱脂奶使用不同的洗脱体积装入凝胶过滤NAP-10柱时测得的乳糖 总量（带误差线）（mM）和总蛋白（Mg/mL）含量1,2 - 烯醇化途径在乳制品中的重要性不及在微酸性食品（如果汁）中，这是由于前者的pH值较高因此，在大部分牛奶原料中T-HMF （游离HMF+结合HMF+HMF 前体物质）通过酸消化法进行不同量（1.30+0.23m mol/L, n= 54））的检测是人为造成 的，因为未经加热的牛奶中不应该有HMF存在（Morales等,1996）.样品经由凝胶过 滤所得的五糖溶液可用于检测所谓的结合HMF,它是专一性的由葡糖胺反应物分解 所得的结合HMF是糖化蛋白（非酶糖基化）的间接度量物，因此可作为加热处理后蛋白质质量的指示物制作无糖样品目标之一是获得去乳糖样品第一步是使用 NAP 柱构建牛奶或牛 奶的类似系统（酪蛋白酸钠加乳糖）的最佳条件按照标准规程的规定，装入 NAP-10 柱的300吐样品（牛奶或类似牛奶的溶液，含15mg乳糖）用1.5mL水回收后并非是 不含乳糖的类似的结果在200yL样品（含大约10mg乳糖）中也有发现。

我们观察 到当大部分蛋白质被洗脱出后（不再有数据显示时），剩余乳糖出现在最后的洗脱液 滴中因此，洗脱液的体积应在1.5mL和0.7mL之间脱脂牛奶的结果如图 1 所示经过凝胶渗透阶段后，溶液中乳糖剩余量随洗脱液体 积的增加呈线性增长当洗脱液体积为0.8mL时乳糖的存在不显著（色谱峰面积比基 底噪声小两倍），但安全起见选择洗脱液体积为0.7mL图2）很明显，总蛋白（主 要是酪蛋白）的回收率随着洗脱液体积的增加而呈线性增长图1显示了不同洗脱液 体积对应的总蛋白浓度（稀释的因素已考虑在内）为简化比较结果，所有样品终体 积均设计为1.5mL用0.7mL洗脱液洗脱时样品中蛋白质的回收率为87.6%，和凯氏 分析所得结果相同，此值应用于之后的分析冷藏条件下，去乳糖样品用于分析时至 少在四天内可维持稳定，未观察到沉淀产生Retention Time (min)图2用1・5mL（7・5 mM乳糖,A）和 0.7 mL （B）蒸®水作为糖洗脱液洗脱的HPLC色谱图图3草酸浓度对两个经过预热的脱脂牛奶样品：SM-I(・); SM-II (口)的酸消化(沸水浴1小时) 过程中总 HMF 产生量的影响120 : 1 1 1 ■ •—0.2 0 斗 0,6 68 1.0Oxalic Add Cone.《SE】 M 也 &ormfflo Oso2 1 1 •苗 Ou . 1 i 1 1 1 i 1—C.2 04 O.e 08 1,0Oxalic Acid Cone. (N)图4样品SM- II总HMF的酸催化释放过程中糖含量变化(乳糖，半乳糖和葡萄糖；mM)：actose (♦), galactose (•), glucose (■)・牛奶酸消化的最佳条件。

葡糖胺化合物在温和条件下相对稳定，在此阶段内只要加 热条件不够激烈或反应时间不够长，美拉德反应实际上是停止的Finot和Mauron, 1972).酸性条件可促进与蛋白质结合的乳果糖基赖氨酸释放HMF,反应速率取决于酸 的浓度和种类传统意义上，草酸已被用于促进发生在葡糖胺反应产物C-3位上的羟 基消除作用和C-1位上去氨基作用之后的1.2-烯醇化，产生3-deoxyosones、HMF和 糠醛；醋酸(2M)也是促进N-取代果糖胺释放HMF的最佳试剂Gottschalk, 1952; van Boekel和ZiaUr-Rehman, 1987)然而，HMF只是反应的中间产物，可分解为其他终 产物(如甲酸、乙酰丙酸)或者浓缩成棕色聚合物Ames, 1992).e6?oEm0.2 CM 0.6 0.0 1 Q。