2022年游离氨基酸总量的测定.pdf

植物体内游离氨基酸总量的测定方法一：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶25ml 或 50ml 3 个；漏斗直径 6 厘米 3个、滤纸适量； 20ml 刻度试管 7 支；移液管 0.5ml 3支、5ml 1 支；试管架；玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封试管口；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅含铁丝筐三、试剂1. 3%茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95% 乙醇溶解定容到100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10 天2. 氰酸盐缓冲液按以下方法配制 ：1NaCN 贮备液 0.01mol/L 490mg/L 2醋酸缓冲液：称 360g 醋酸钠含三分子结晶水溶于约300ml 无氨蒸馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L取溶液 120ml，用溶液 2定容到 1L3. 标准氨基酸精确称取在 80下烘干的亮氨酸13.1mg或 mol，或氨基氮 7g4. 95%乙醇；异丙醇分析纯 四、操作步骤精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 5 页1. 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 18 支，按下表 1 加入各试剂。

加完试剂后混匀， 在 100水浴中加热 12min加热时封口，取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95% 乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色于570nm波长下测其光密度以空白管为参比 ，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程2. 样品提取选取有代表性的植物叶片 或其它组织，洗净擦干， 剪碎混匀，迅速称取 0.100.20g 视氨基酸含量多少而定 ，共称 3 份，分别加入 20ml 刻度试管中，再加蒸馏水10ml 盖塞或系上塑料薄膜 ，置沸水浴中 20min 以提取游离氨基酸， 到时取出在自来水中冷却， 把上清液滤入 25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml 蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀3. 样品测定另取 4 支洁净干燥的试管，其中3 支分别加入 0.5ml 提取液，另一支加 0.5ml 蒸馏水，然后在上述 4 支试管中分别加入NaCN 缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml ，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加 5ml 95% 乙醇，摇匀，以空白作参比， 在波长 570nm下测其光密度。

根据光密度查标准曲线 或用回归方程计算 即可求出提取液中氨基酸的浓度方法二：一、原理游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物， 其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比二、仪器设备分光光度计；电子天平；容量瓶25ml 或 50ml 3 个；漏斗直径 6 厘米3个、滤纸适量； 20ml 刻度试管7 支；移液管 0.5ml 3 支、5ml 1 支；试管架；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 5 页玻棒；吸耳球；剪刀；移液管架；橡皮筋、塑料薄膜封试管口；吸水纸；擦镜纸适量；电炉；水浴锅含铁丝筐三、试剂1. 3%茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到 100ml 容量瓶里，贮于棕色瓶中 此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10 天2. 氰酸盐缓冲液 按以下方法配制：1NaCN 贮备液 0.01mol/L 490mg/L 2醋酸缓冲液：称360g 醋酸钠含三分子结晶水溶于约300ml 无氨蒸馏水中，加 66.67ml 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L取溶液 120ml，用溶液 2定容到 1L3. 标准氨基酸精确称取在 80下烘干的亮氨酸13.1mg 或 -丙氨酸 8.9mg溶于 10%的异丙醇中，并在 100ml 容量瓶中用 10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L 的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。

为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L ，即 1ml 含氨基酸 0.5mol ，或氨基氮7g 4. 95%乙醇；异丙醇分析纯四、操作步骤精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 5 页1. 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管 18 支，按下表 1 加入各试剂加完试剂后混匀，在 100水浴中加热 12min加热时封口，取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色于570nm 波长下测其光密度以空白管为参比，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程表 1 各试管加入试剂量2. 样品提取选取有代表性的植物叶片或其它组织，洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取 0.10视氨基酸含量多少而定，共称3 份，分别加入 20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml 盖塞或系上塑料薄膜，置沸水浴中20min 以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml 容量瓶中，之后再往试管中加 5ml 蒸馏水，置沸水浴上再加热10min ，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。

3. 样品测定另取 4 支洁净干燥的试管，其中3 支分别加入 0.5ml 提取液，另一支加 0.5ml 蒸馏水，然后在上述4 支试管中分别加入 NaCN 缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min ，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm 下测其光密度根据光密度查标准曲线 或用回归方程计算 即可求出提取液中氨基酸的浓度精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 5 页4. 计算游离氨基酸含量式中C：由直线方程计算的值，即0.5ml 试样中氨基酸的微摩尔数mol ；V：样品提取液经稀释后的总体积ml；W：样品重 g测定结果按表 2 记录表 2 游离氨基酸总量测定记载表精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 5 页。