基因克隆的酶学基础-2.ppt

分子克隆工具酶及其应用分子克隆工具酶及其应用l限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 lDNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 l核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 l核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 l核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 l核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 l其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯 化、检测等第一节限制性内切核酸酶一 . 限制性内切酶的发现1. 细菌限制修饰系统的发现Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶2. 限制酶HindII的发现H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血 杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱 二 . 限制修饰系统的种类 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（ host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一 个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５— 腺苷甲硫氨酸）。

2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基 因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具 有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于 基因工程中 三. 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名 称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)四．限制酶的特点1. 识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI 5’-G A A T T C-3’3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是 ５’-Ｐ和３’-ＯＨ2. 末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’３） 平齐末端SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI 5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ５）相容性末端 如：BamHI G GATCCBglII A GATCTMboI, Sau3AI N GATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组 分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率 只有1/16。

BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切BamHI + BglII A/G GATCT/C不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶2. 特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnI GGTAC C Asp718 G GTACCSstI CCGC GG SacI CCGC GG 六.限制酶的星反应（star activity）七. 1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）3. 星反应的利用和避免表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 AvaI 1, 2, 4 BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC BstI 2, 4 BsuI 2, 4, 6 EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTN HaeⅢ 2, 4 HhaI 2, 4, 7 HindⅢ 6 HpaI 1, 2, 4 PstI 1, 2, 4, 7 PvuⅡ 2, 4 SalI 1, 2, 4, 7 ScaI 4 - 6, 8 SstⅡ 2, 4 XbaI 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。

七. 其它特异性的内切酶及其用途1. λ末端酶（λ terminase）： 5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）2. Omega核酸酶（I-SceI）：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为 5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’ TATT 3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum 识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT4. 用途遗传标记， 构建载体八. 限制酶的用途 1. DNA重组2. 限制酶（物理）图谱绘制3. 突变分析（RFLP分析）4. 限制酶的部分酶切与完全酶切 附：IIS型限制酶的特点1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。

5. 均为单体，分子量为47—108 kD第二节 DNA 甲 基 化 酶 一. 甲基化酶的种类与识别顺序1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制 酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同 如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修 饰系统dam G mATC， dcm C mCA/TGG 3. 哺乳动物的甲基化酶该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与 DNA复制、基因转录等过程有关4. E．coli中依赖于甲基化的限制修饰系统 mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）二. 甲基化酶活性对限制酶活性的影响1. dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序 是完全重叠还是边界重叠如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG)边界重叠 ClaI--dam； Sau96I--dcm2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重 叠如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm--BstNI表2 对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶 识别序列* 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列2. II型甲基化酶对限制酶活性的影响 １） 抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCC—BamHI(GGATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(GAATTC)２） 抑制不同种限制酶的活性a. 顺序完全重叠 如：M. Cla。