尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序.doc

1尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶 Agacutin 的亚基的拆分和氨基酸残基测序作者：唐松山，唐治华，李红枝，游娟【摘要 】 目的 测定 Agacutin 两个相近亚基的 N 端 15 个氨基酸残基序列，酶分子的 2 个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序方法 通过生物化学方法获得高纯化 Agacutin，经 SDS-PAGE 电泳分离、亚基胶条回收及 PVDF 膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过 Edman 降解法，测定了亚基 N 端15 个氨基酸残基序列结果 大亚基(16 kDa)的序列为：DCSSGWSSYEEHQYY，小亚基(15 kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV结论 测序结果经 NCBI 数据库检索发现，Agacutin 为新的蛇毒类凝血酶 【关键词】 尖吻蝮蛇蛇毒; 类凝血酶; 亚基拆分; 蛋白 N 端测序Abstract:Objective To sequence N terminuses of the close two subunits of Agacutin,the separation of single subunit was completed for the sequencing.Methods The single subunits of Agacutin were obtained by using SDS PAGE,subunit gel recovery and electrical transfer 2technique. The Edman degradation method was used for the sequencing.Results The subunit sequences of the 16 and 15 kDa were determined to be DCSSGWSSYEEHQYY and DSSGWSSYEGHEYYV,respectively.Conclusion According to above sequencing results,the NCBI Blast comparison showed that Agacutin is a novel thrombin like enzyme.Key words:Agkistrodon acutus snake venom; thrombin like enzyme; subunit separation; protein N terminal sequencing.蛇毒含有许多特殊蛋白酶和活性多肽,这些酶可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒神经毒和出血毒的主要原因。

自 1995年以来，一系列对血液凝固系统起作用的结构和功能多样性的酶自尖吻蝮蛇蛇毒中被纯化1995 年,Chen YL 等[1] 纯化了Agkicetin(14 和 15 kDa 的异二聚体)，它具有 GP1b 拮抗剂和血小板抑制活性;1998 年,Yeh CH 等[2]纯化了 Accutin(5.241 kDa)，一个新的整合素成员，它潜在性地抑制血小板聚集;1999 年，Huang 等[3]报道了类凝血酶 Acuthrombin A(28 kDa)和Acuthrombin C(69 kDa);Cheng X 等[4] 纯化了纤维蛋白溶解酶Agkisacutacin(14 和 15 kDa 的异二聚体);Pan H 等[5]成功克隆了Acutin(38 kDa)，一个具有去纤化功能的类凝血酶;2000 年，Xu XL3等[6]报道了 2 个抗凝血类凝血酶 ACF I (Anticoagulation Factor I)和 ACF Ⅱ(Anticoagulation factor Ⅱ)(14.6 和 14.7 kDa 的异二聚体);2001 年,Yeh CH 等[7]报道了血小板糖蛋白 Ib 拮抗剂 Agkistin(16.5 和 15.5 kDa 的异二聚体)和 Liang XX 等[8]报道了纤溶酶 FⅡ(a)(26 kDa);2003 年，郑颖等 [9]纯化了 2 个类凝血酶;2004 年,李婷等[10]纯化了抗凝血功能的类凝血酶 (14.4 和 17 kDa的异二聚体); 吴忠和苏薇薇报道了具有止血活性的类凝血酶Halase[11,12]。

自 1993 年起，本课题组尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离具有止血功能的类凝血酶目前，已获得 5 个以纤维蛋白原为底物的酶，进一步的研究发现，至少有 2 个酶具有止血活性， Agacutin 是被研究的最全面的一个本文报道了 Agacutin 的亚基拆分和 N 端 15个氨基酸残基序列测定1 材料与方法1.1 试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、TRIS 和CAPS{3 [Cyclohexylamino] 1 propane sulfonic acid} 购自Promega 公司;PVDF 膜为 Bio Rad 公司产品; 可逆性蛋白质快速染4色试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品;Agacutin 类凝血酶由昆明龙津药业有限公司提供;其余试剂为国产分析纯1.2 仪器Mini PROTEAN Cell 电泳槽、Mini Trans Blot 电转移槽和 PowerPac HC 电源均为 Bio Rad 公司产品，水平电泳槽为北京六一仪器厂产品1.3 Agacutin 亚基拆分1.3.1 SDS PAGE 分离 采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶(胶浓度∶交联度=15∶3.9)，聚合过夜，用 0.01 mA 恒流预电泳 2 h,上样后以 200 V 恒压电泳 45 min。

1.3.2 可逆性蛋白快速染色 用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液 50 mL,震荡 5 min待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗 2～3 min，洗去多余染液将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25 mol/L Tris HCl,0.25 mol/L EDTA,pH 8.5)脱色20 min条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移51.3.3 蛋白回收 将含 2 种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10 kDa 的 10 mm 透析袋的一端，充满透析液，扎紧将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在 SDS PAGE 电泳缓冲液中 120 V恒压 2 h，再反向电泳 1 min剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移1.3.4 单亚基纯度鉴定 采用 SDS PAGE 电泳(T∶C=15∶3.9)，经考马斯亮蓝 R 250 染色，并用脱色液脱至本底无色1.3.5 电转移1.3.5.1 CAPS 电转移缓冲液 取 200 mL 的 CAPS 储存液(CAPS 22.13 g，加去离子水至 900 mL，用 2 mol/L NaOH 调 pH值至 11.0，定容至 1 L)，加甲醇 200 mL 和去离子水 1 600 mL。

1.3.5.2 取 PVDF 膜，用甲醇浸泡 10 s，然后放入 CAPS 电印迹缓冲液中用 CAPS 缓冲液浸泡过物件按海绵-滤纸-PVDF 膜-凝胶-滤纸-海绵的顺序装好夹层，放入小型电转槽中，在 60 V 恒压条件下，于室温下进行电转移，转移时间为 1.5 h61.3.5.3 取出 PVDF 膜用去离子水略漂洗，用甲醇浸泡 10 s，然后进行考马斯亮蓝染色(0.1%考马斯亮蓝 R 250 溶于 40%甲醇和 1%乙酸)，染色 50 s用 50%甲醇脱色后，用去离子水充分洗涤，剪下待测序的条带1.4 Agacutin 亚基的 N 端氨基酸残基测序通过反相 HPLC 分析和乙腈洗脱，采用 Edman 降解法测定亚基的 N 端 15 个氨基酸残基序列(ProciseR cLC 蛋白自动测序仪，Applied Biosystems Co.),蛋白测序仪可自动显示测序峰2 结 果2.1 Agacutin 纯品鉴定Agacutin 纯品经 SDS PAGE 电泳鉴定，在 16 和 15 kDa处显示相近的 2 条带(图 1)在该电泳条件下，2 μg 的上样量显示亚基得到有效分离2.2 单亚基鉴定Agacutin 纯品经 SDS PAGE 电泳分离，可逆性蛋白快速染7色，分别切下含 2 个亚基的条带，经电泳洗脱亚基单肽链。

回收的亚基在 SDS PAGE 电泳胶上分别显示 16 和 15 kDa 的单一条带(图 2)2.3 亚基电转移电洗脱回收的 2 个亚基，经 SDS PAGE 电泳浓缩为狭窄的条带，电印迹到 PVDF 膜，经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后，分别显示为单一蛋白条带(图 2)2.4 亚基测序2.4.1 对照样品测序结果 阳性对照见图 3A，阴性对照见图3B2.4.2 小亚基测序结果 15 kDa 亚基 N 端 15 个氨基酸残基序列为 DSSGWSSYEGHEYYV,见图 42.4.3 大亚基测序结果 16 kDa 亚基序列为DCSSGWSSYEEHQYY，见图 53 讨 论8自 20 世纪 70 年代起，许多蛇毒蛋白酶如Ancrod、Batroxobin、Crotalase 和 Reptilase (立止血)等先后被发展成临床药物这些药物在血液止血和栓塞疾病的治疗中扮演一定的角色由于立止血在临床上的有效性和低毒性，该类凝血酶在1996 年已成为国家基本药物尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)主要分布在我国华南、台湾和泰国、缅甸，因此该蛇毒的研究主要集中在亚洲各国根据 SDS PAGE 技术和家兔血凝固时间变化，筛选了止血蛋白 Agacutin。

在该蛋白酶的纯化过程中，尖吻蝮蛇蛇毒中许多分子量、等电点和凝结活性相近的蛇毒蛋白长时间地影响了纯化工艺Figure 5 N terminal 15 amino acid residue sequencing of 16 kDa subunit 本研究采用 SDS PAGE 电泳方法，对组成类凝血酶 Agacutin 的 16 和 15 kDa 亚基进行了分离通过切割分离含 2 个亚基的胶条，电洗脱回收，得到了单一亚基条带，并转移至PVDF 膜进行了成功测序从 SDS PAGE 图谱可知，该蛋白质的15 和 16 kDa 两亚基非常相近，如果一种测序样品混合了很少量的另一种亚基肽链，测序结果可能不可靠此外，拆分和测序结果成功与否，还取决于回收样品的鉴定结果和量鉴于方法学的限制，本来就极少量的亚基纯品，在资金和仪器条件限制下，其鉴定过程就更加困难本文通过 SDS PAGE、亚基胶条回收和电转移技术相9结合，简单地解决了这样的测序问题，即使纯化样品纯度不高，该方法也很有效，所以该亚基分离方法和测序有一定的实际意义SDS PAGE 分析显示，Agacutin 是一个 15 和 16 kDa 亚基组成的异二聚体。

大亚基 N 端 15 个氨基酸残基序列为DCSSGWSSYEEHQYY 和小亚基序列为 DSSGWSSYEGHEYYV通过 NCBI Blast 序列比较分析，15 和 16 kDa 亚基分别与凝血因子X 结合蛋白 Agkisacutacin 的 A 链有最大 66.7%和 73.4%的序列同源性(GenBank accession no.1WT9 A [gi / 93278427], Chain A, Crystal Structure of Aa X Bp I, A snake venom protein from Deinagkistrodon acutus snake venom)按照新药申报模式，I 类新药的蛋白质药物，必须测定 N 端15 个氨基酸残基，以确定它是否是新的蛋白质因为这样的 N 端序列完全同源有。