菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究.pdf

广东海洋大学 硕士学位论文 菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究 姓名：韩兆轩 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：王维民 20090501 菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究 摘要 植物类黄酮化合物具有抗氧化、降血脂、抗衰老、治疗心血管疾病等保健功 能本文以菠萝皮为材料，对菠萝皮中类黄酮化合物的提取工艺和分离纯化条件 进行了优化，通过颜色反应法，紫外吸收光谱法来初步鉴定菠萝皮中的类黄酮化 合物，并研究其抗氧化和降血脂功能活性，为开发和利用这一资源提供理论依据 1 ．采用铝盐．分光光度法测定菠萝皮中类黄酮物质的含量，用芦丁标准品作为 标准对照物，测定波长为5 1 0 n m ，显色后1 5 分钟内进行吸光值测定；芦丁标准 工作曲线的标准方程为：Y = 0 ．0 0 7 2 X + 0 ．0 0 3 8 ，相关系数R 2 = O ．9 9 9 5 ( R 2 0 ．9 5 ) ： 菠萝皮总类黄酮含量为2 4 ．4 6 m g ／g 2 ．对菠萝皮中类黄酮的最佳提取条件进行了研究采用溶剂提取法、超声波提 取法和纤维素酶法提取三种方法，综合考虑确定了超声波提取是最佳的提取方 法，确定了6 0 ％( v ／v ) 7 , 醇，料液比1 ：5 0 ( w ／v ) ，浸提时间O ．5 小时，温度7 0 。

C ，功 率3 5 0 W 为菠萝皮中类黄酮的最佳浸提条件在此条件下所得浸提液每克菠萝皮 中含有黄酮2 1 ．3m g ，则可得其浸提率为8 7 ．0 8 ％ 3 ．在得到类黄酮化合物粗提液后，对粗提液中的类黄酮化合物的纯化方法进 行了探索，结果表明A B ．8 型大孔吸附树脂对菠萝皮类黄酮有较好的吸附分离性 能，采用吸附流速为l m L ／m i n ，上样液浓度为2 ．2 5 m g ／m L ，原液p H 值为6 ，洗 脱剂为9 0 ％乙醇溶液，洗脱流速为0 ．5 m L ／m i n ，洗脱剂用量为2 0 0 r n L ，为最佳纯 化条件，经过A B ．8 型大孔吸附树脂精制后，产品中类黄酮物质的纯度为3 5 ．6 5 ％， 精制倍数达3 ．3 2 ，回收率为8 2 ．7 9 ％纯化后的样品通过颜色反应法及紫外吸收光 谱法初步鉴定，确定为黄酮类或黄酮醇类化合物 4 ．利用S e h a a l 烘箱法检测菠萝皮类黄酮纯品( P P F ) 对油脂过氧化值的影响， 同时通过邻苯三酚自氧化法检测P P F 对超氧阴离子的清除能力；考察P P F 对羟 自由基的清除能力，初步探讨P P F 抗氧化功效。

结果显示：P P F 具有一定的抗氧 化功效，添加0 ．7 ％P P F 的猪油过氧化值最低，效果最佳；菠萝皮类黄酮粗品 ( C P P F ) 和P P F 对超氧阴离子均具有一定的清除作用，量效成J 下相关，当C P P F 浓 度达O ．7m g ／m L 时，抑制率达1 5 ．9 6 ％；当P P F 浓度达0 ．4 0 2m g ／m L 时，抑制率 达4 1 ．1 8 ％；P P F 对羟自由基具有一定的清除作用，当其浓度为0 ．1 3m g ／m L 的P P F 清除能力最强，清除率达到5 9 ．8 7 ％ 5 ．通过建立实验小鼠高血脂症模型，探讨菠萝皮类黄酮降血脂效果结果显 示不同剂量组的菠萝皮类黄酮具有调节血脂的作用，能显著降低血清总胆固醇 ( P 提取温度 料液比 2 ．2 ．2 ．2 纤维素酶一乙醇提取试验研究结果 2 ．2 ．2 ．2 ．1P H 值对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 在料液比为l ：1 0 0 ( 质量：体积) ，温度4 0 ℃，浸提时间2 h ，乙醇浓度8 0 ％， 加酶量1 ．5 ％，样品浸提一次的固定条件下，比较不同p H 值对菠萝类黄酮得率的 影响，结果如图2 ．8 所示。

1 9 菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究 3 ．544 ．555 ．566 ．5 P H 值 图2 - 8 ．p H 值对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 - 8I n f l u e n c eo fw a t e ra c i do ny i e l do ff l a v o n o i d s 由图2 ．8 可以看出，在p H 值在4 ．O ．4 ．5 条件下，随着p H 值的增大，总黄酮得率显 著提高，在4 ．5 ．6 ．0 条件下总黄酮得率随着p H 值的增大而下降酶活力受p H 的影响， p H 不仅能够影响酶的构象，也影响底物的解离状态，结果说明纤维素酶在p H = 4 ．5 条件下p H ，活性较好，所以将酶解p H 值定为4 ．5 2 ．2 ．2 ．2 ．2 乙醇浓度对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 在料液比为1 ：l o o ( 质量：体积) ，温度4 0 “ ( 2 ，浸提时间2 h ，p H 4 ．5 ，加酶量 1 ．5 ％，样品浸提一次的固定条件下，比较不同乙醇浓度对菠萝类黄酮得率的影响， 结果如图2 ．9 所示 O ．0 9 0 ．0 8 5 《0 ．0 8 篓o ．0 7 5 督O ．0 7 0 ．0 6 5 O ．0 6 3 04 05 08 07 0 8 0 9 0 乙醇浓度( ％) 图2 - 9 ．乙醇浓度对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 ·9I n f l u e n c eo fc o n t e n to f e t h a n o lo ny i e l do ff l a v o n o i d s 由于纤维素酶能够有效的破坏植物细胞壁，有利于内容物的流出，可以使乙醇 更完全的提取菠萝皮中的类黄酮。

由图2 - 9 可以看出，随着乙醇浓度的增加，黄酮得率也增大，当乙醇浓度达 到7 0 ％时，黄酮类化合物溶解度最大，得率最高；而后，乙醇浓度再增加，黄酮 类化合物溶解度减少：同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加， 2 0 5 7 5 6 5 5 7 O 6 O 5 O O ． O ． O ． ． O ． O ． O O O O 《靼米督 广东海洋大学硕士学位论文 干扰因素随之增大，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇．水分子结合，从而导 致黄酮类化合物的得率下降由于纤维素酶的作用，乙醇穿透细胞能力增强，故 比单纯的乙醇热回流提取方法中的乙醇浓度少了1 0 ％溶剂浓度过大，可能会溶 解原料中的一些脂溶性物质，对实验形成干扰作用综上考虑，乙醇浓度在7 0 ％ 左右较为合适 2 ．2 ．2 ．2 ．3 加酶量对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 在料液比为1 ：1 0 0 ( 质量：体积) ，温度4 0 ℃，浸提时间2 h ，p H 4 ．5 ，乙醇浓 度7 0 ％，样品浸提一次的固定条件下，比较不同加酶量对菠萝类黄酮得率的影响， 结果如图2 ．7 所示 O 加酶量( ％) 23 图2 ．1 0 ．加酶量对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 - 1 0I n f l u e n c eo f e n z y m ed o s a g eO ny i e l do f f l a v o n o i d s 由图2 ．1 0 可以看出，随酶用量的增大，总黄酮得率逐步提高。

增加酶用量可 以提高酶促反应速度，同时酶浓度对反应速度的影响具有饱和现象，即当酶浓度 较高时，反应速度并不随酶浓度的增加而成比例增大综合考虑最佳酶用量应为 物料重的1 ．0 ％左右 2 ．2 ．2 ．2 ．4 提取温度对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 在料液比为1 ：1 0 0 ( 质量：体积) ，加酶量= 1 ．0 ％，浸提时间2 h ，p H 4 ．5 ，乙醇 浓度7 0 ％，样品浸提一次的固定条件下，比较不同加酶量对菠萝类黄酮得率的影 响，结果如图2 ．1 l 所示 2 l 5 8 8 O O ． ． O O 《颦皋整 菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究 0 ．0 9 5 O ．0 9 0 ．0 8 5 l 避0 ·0 8 蓄o ．0 7 5 O ．0 7 0 ．0 6 5 O ．0 6 2 04 06 0 温度( ℃) 图2 - 1 1 ．温度对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 - 11I n f l u e n c eo f e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r eo ny i e l do f f l a v o n o i d s 由图2 ．1 1 可以看出，随着温度的升高，酶的活性也升高，酶促反应加快，总黄 酮得率也随之提高，但温度过高，得率有下降的趋势。

当温度升高到一定程度时， 酶蛋白开始受热变性，使酶的活性降低，从而降低了总黄酮得率故最佳酶解温 度应在4 0 , - - - 5 0 * ( 2 2 ．2 ．2 ．2 ．5 纤维素酶一乙醇法提取正交实验结果与分析 表2 ．7 纤维素一乙醇提取正交实验结果与分析 T a b ．2 - 7R e s u l to fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 由表2 ．7 的正交结果可知，菠萝废弃物类黄酮的最佳提取工艺为：p H = 5 ．0 、 乙醇浓度7 0 ％，温度5 5 ℃．在此条件下，提取率最高各种因素对提取效果影响 的主次顺序依次为：提取温度 p H 乙醇浓度 2 ．2 ．2 ．3 超声波萃取试验研究结果 2 ．2 ．2 ．3 ．1 乙醇浓度对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 广东海洋大学硕士学位论文 在料液比为1 ：5 0 ( 质量：体积) ，功率4 0 0 W ，浸提时间3 0 m i n ，温度7 0 “ 1 2 ， 样品浸提一次的固定条件下，比较不同乙醇浓度对菠萝类黄酮得率的影响，结果 如图2 ．1 2 所示 3 04 5 0 0“ ／59 0 乙醇浓度( ■) 图2 ．1 2 ．乙醇浓度对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 —1 2I n f l u e n c eo f c o n t e n to f e t h a n o lo ny i e l do f f l a v o n o i d s 超声波提取是一种用于科学研究的新提取技术，通过控制一定的超声频率和 强度，利用超声波的空化效应、热效应和机械效应，造成植物细胞壁及整个生物体 瞬间破裂，加快细胞内物质的释放、扩散及溶解，从而能提高植物成分的提取效率。

由图2 ．1 2 可以看出，，在一定的乙醇体积浓度范围内，随着乙醇体积浓度的增 加，菠萝皮渣中总黄酮的提取量逐渐增大，当乙醇体积浓度达到6 0 ％时，提取量最 大；乙醇体积浓度继续增加，总黄酮的提取量反而相应降低当乙醇体积浓度为 6 0 ％时，提取溶剂的极性与菠萝皮渣中黄酮类物质的极性比较一致，根据相似相溶 原则，此时能实现对总黄酮的最大量提取乙醇浓度再增加，黄酮类化合物溶解 度减少：同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，干扰因素随 之增大，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇．水分子结合，从而导致黄酮类化 合物的得率下降故选择浓度6 0 ％乙醇提取菠萝皮渣总黄酮 2 ．2 ．2 ．3 ．2 功率对菠萝类黄酮提取率影响的实验结果 在固液比为l ：5 0 ( 质量：体积) ，乙醇浓度6 0 ％，浸提时间3 0 r a i n ，温度7 0 度，样品浸提一次的固定条件下，比较不同功率对菠萝类黄酮得率的影响，结果 如图2 ．1 3 所示 5 8 5 7 5 6 ∞ 巾 叮 一 ∞ 巾 ． O ． O ． O O O O 《姆米瞽 菠萝皮类黄酮分离纯化及降血脂作用研究 1 5 02 0 02 5 03 0 03 5 04 0 04 5 0 功率( - ) 图2 ．1 3 ．功率对类黄酮提取率的影响 F i g ．2 - 13I n f l u e n c eo f p o w e r o ny i e l do ff l a v o n o i d s 超声波功率指超声波清洗器单位时间内输出总能量。

在其它条件不变的情况。