端粒相关蛋白在某些重大疾病中的调节机制.docx

端粒相关蛋白在某些重大疾病中的调节机制揭示宫颈癌中端粒酶的调控机制，尤其是端粒相关蛋白磷酸化及 其在基因转录水平上的调控，提出抑制肿瘤细胞永生化的新策略研 究端粒相关蛋白在特异性肺纤维化的作用研究方法及内容：（1）端粒相关蛋白质磷酸化与去磷酸化在宫颈癌细胞中的调控 机制:前期研究表明，端粒酶磷酸化后，将会提高端粒酶活性；反之 蛋白磷酸酶 2A 去磷酸化，抑制端粒酶活性通过点突变筛选22 个潜 在的 TERT 磷酸化位点，我们发现两个可能性高的磷酸化位点，分别 位于 TERT 蛋白 C 末端和中心序列的丝氨酸残基我们将以宫颈癌细 胞为模型，研究TERT磷酸化的机制，确定参与TERT磷酸化的蛋白激 酶及其信号通路待检查的蛋白激酶包括ATR, ATM和DNA依赖性蛋 白激酶我们将研究磷酸化和去磷酸化的 TERT 与 hTERC 与端粒 DNA 以及与其它端粒相关蛋白复合体的相互作用研究P0T1磷酸化对其 调控的机制，尤其是与端粒酶及端粒DNA相互作用和转换机制我们 推测，在POT1/TPP1招募TERT与端粒DNA结合、在端粒DNA与不同 的端粒蛋白复合体切换过程中，蛋白质磷酸化/去磷酸化是一个重要 的开关式调节机制。

我们将应用重组的蛋白质研究磷酸化对蛋白之 间、蛋白和端粒DNA之间的相互作用在临床宫颈癌标本和培养的细 胞内，在鉴定基因表达后，通过免疫沉淀、质谱分析及磷酸化标记等 方法，确定端粒相关蛋白的磷酸化调控机制用不同突变体和抑制剂 及免疫去除等方法作特异性对照，鉴定端粒相关蛋白磷酸化对端粒长 度的影响和对细胞分裂的作用2）表观遗传学及 FOX 基因转录抑制因子在宫颈癌细胞中对 TERT基因转录调控机制:在端粒酶调控的机制中，激活TERT基因转 录是关键的一个环节，TERT基因转录主要调节因子包括c-myc, Spl 和Ets2本研究将实时测定宫颈癌细胞中TERT表达、TERT启动子转 录活性和TERT全长启动子DNA甲基化应用ChIP及Re-ChIP技术系 统分析不同细胞周期TERT全长启动子(9kb)与各种不同转录因子的 结合，绘制TERT全长启动子DNA甲基化、DNA甲基转移酶、各种组 蛋白修饰酶的募集和组蛋白H3 (H3-K9、K14)、H4 (H4-K5、12、16) 乙酰化，甲基化(H3-K4、K9，K27、K36，H4-K20)状态的图谱确 定特异转录因子与不同组蛋白修饰酶募集的相关关系，最终阐明肿瘤 细胞在不同信号通路整合后的TERT基因调控网络。

我们将研究TGF 下游FOX蛋白对TERT基因的调节作用，包括与其它基因转录因子(如 c-myc和Ets2)以及对癌细胞增殖的调节作用FOX蛋白特征是有一 个叉头的结构域，由80到100个氨基酸残基形成，能与富含腺嘌呤 DNA序列结合我们将筛选FOX蛋白中不同的亚型(FOXA到FOXS)， 包括Akt/PTEN，研究磷酸化调控的FOX对TERT基因启动子活性的调 控及机制我们推测，通过调节TERT基因表观遗传学特征和FOX转 录抑制因子，有可能控制宫颈癌细胞端粒酶活性和永生化3) TGF受体对端粒酶TERT基因调节的机制：前期研究显示， TGF RII受体介导BMP对端粒长度的正负调控作用我们将研究具 有不同特异性的RI受体(ALK1, ALK2, ALK3和ALK6)传递来自RII 受体的信号，产生对TERT基因的调节和不同的端粒重塑效果为鉴 定出相应的 RI 受体，采用突变、显性正相和负相基因表达方法，检 测端粒酶活性和端粒长度包括分别对ALK3的Q239和W271实施突 变，使 ALK3 失活，从而完全阻断 ALK3 信号通路；而在甘氨酸-丝氨 酸丰富的激活区(GS区域，RI受体激酶区之前的30个氨基酸)实施 R206H(或者617G-A)突变，可激活ALK2。

在不同的细胞因子刺激的 宫颈癌细胞中，研究 RI 受体的过表达和低表达对 Smad1/5/8 和 Smad2/3 磷酸化的影响测定端粒酶活性和端粒长度、确定癌细胞增 殖、衰老和凋亡这些研究将揭示TGF RI受体是如何介导调节宫颈 癌细胞中端粒酶活性和端粒的长度4) 端粒酶对恶性肿瘤转移的调节作用：前期工作表明，端粒酶 的表达增加肿瘤细胞转移过程中的上皮细胞向间充质细胞的转变 (EMT)而抑制端粒酶将导致EMT降低，有可能通过调节EMT影响癌 细胞的转移为了探讨TERT是否促进正常上皮细胞EMT和去分化， 从外科切除的胃肠组织标本中获取正常胃、肠上皮细胞，改变 TERT 在这些细胞中的表达，观察细胞在形态学、EMT、干细胞标志及细胞 功能方面的变化比较不同TERT表达水平细胞的基因及miRNA表达 变化，以期发现下游的效应分子或特异miRNAso同时寻找与TERT相 互作用，介导 EMT 的中间分子， TERT 与 EMT 调节通路相关因子的可 能作用也一并加以分析另外，TERT的这一作用是否依赖于端粒延 长功能也将通过表达变异的TERT加以澄清研究TERT对EMT的作用 将为防治肿瘤细胞转移提供新的靶点。

5）端粒相关蛋白在特发性肺纤维化 （Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）中的作用：IPF是成年人（〉40岁）发作的慢性间质性 肺病，临床诊断困难，5年死亡率很高，国内研究很少家族性IPF 有15%携带杂合子TERT基因突变，而非家族性IPF只有1-3%有TERT基因 突变TGF0 1下游Smad3蛋白过表达引发IPF,但机制尚不清楚我们 发现Smad3是TERT基因转录抑制因子，因此TG叩1-Smad3-TERT通路出 现异常，或者其它端粒相关蛋白调节端粒酶发生障碍，可能导致TERT 表达水平降低从而参与肺细胞衰老和IPF发病过程我们将从IPF肺活 检样品中检测Smad3和TERT表达水平，POT1和TPP1基因的完整性及表 达水平，端粒酶活性及端粒长度我们将进一步检测TGF0 1RII和RI 受体的激活与端粒酶抑制的关系所有检测将与正常组织对照进行比 较研究结果将为IPF分子病理诊断和基因治疗靶点提供重要的基础 理论依据。