细胞培养技术(实验篇)四.ppt

细胞培养技术（实验篇）,安徽医科大学微生物学教研室,2013年1月3日 合肥,实验四,一、VSV TCID50滴定,二、干扰素效价测定（一）,三、中和试验（一）,一、VSV TCID50滴定,实验目的,掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法 熟悉病毒TCID50的应用,实验原理,多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解、细胞肿大或脱落等，这种改变称为病毒的致细胞病变效应（CPE) TCID50 （50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的传统表示法， 即能在50%组织细胞培养孔或试管内引起细胞病变所需的病毒最高稀释度TCID50滴定法是50%（50% endpoint)终点法测定病毒滴度的方法之一，是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至培养成的单层细胞，将每个稀释度造成的细胞病变做成曲线，找出造成50%细胞病变的终点稀释度实验材料,细胞：Hep-2细胞株 病毒：水泡性口炎病毒（VSV) 试剂：DMEM培养液(或RPMI1640)，小牛血清，PBS， VTP 材料：细胞板，微量移液器，tip头,实验步骤,细胞的制备与培养(已完成） 病毒的稀释与接种 结果观察与计算: 结果的记录时间为感染细胞的病变不再进展为止，不同的病毒不一样，本实验所用的水泡性口炎病毒（VSV)增殖较快，一般48小时左右即可观察染色。

计算方法常用的有Reed-Muench法制备细胞(已经完成）：按传代细胞培养的方法制备Hep-2细胞悬液，细胞浓度约为1× 106/ml用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃，5%CO2培养箱中培养24h，形成良好的单层 病毒稀释：用含3%小牛血清的DMEM(或RPMI1640）维持液将待测病毒VSV作连续10倍稀释，依次为10-1、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 、 10-7稀释病毒液,待测VSV,DMEM维持液,管号,,,,,,,,,,,,,稀释度,病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔培养液全部倾弃，用微量加样器将各稀释度VSV病毒液加入相应孔中，每孔100μl，每个稀释度加2孔同时设细胞对照孔，不加病毒液，只加维持液37℃，5%CO2培养箱中培养1 2 3 4 5 6 7 8 9 C,DMEM维持液,,复孔,试验孔,结果观察：于培养后的不同时间，18h、24h、48h在倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病变不再发展时记录结果，细胞病变程度表示法如下：-：表示无细胞病变+：表示1%～25%的细胞有病变++：表示26%～50%的细胞有病变+++：表示51%～75%的细胞有病变++++：表示76%～100%的细胞有病变,Reed-Muench法计算TCID50，举例如下：,由上表可知病毒的TCID50介于10-4与10-5两个稀释度之间，两稀释度之间的距离比计算如下：,,,,高于50%病变的百分数-50% 距离比例= - ×lg稀释倍数高于50%病变的百分数-低于50%病变的百分数83-50= - ×lg10=-0.76783-40lgTCID50=高于50%病变的稀释度的对数+距离比例=(-4)+(- 0.767)=-4.767 则该病毒的TCID50=10- 4.767/0.1ml，即此病毒的10- 4.767的浓度（1∶63000） 0.1ml接种一组细胞孔后，可使50%的细胞感染病变。

如何计算200 TCID50？ 200 TCID50=63000/200=315，将病毒作315倍稀释时即得200 TCID50的病毒液注意事项,不同的病毒应选用各自敏感的细胞 接种病毒前细胞单层必须良好 接种病毒时应从低浓度向高浓度方向加样，防止跳管现象二、干扰素效价测定（一）,（8组做此实验）,实验目的,掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本步骤以及结果分析 熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义 了解影响结果的常见因素实验原理,何谓干扰素？病毒或其他干扰素诱生剂作用于人或动物的白细胞、T细胞或成纤维细胞后，刺激细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的一类小分子糖肽，统称为干扰素具有间接的广谱抗病毒作用实验原理,为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定 干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升实验原理,测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制法”（Method of Cytopathic effect inhibition assay）。

此法的主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常规亦可用“放射化学测定法”、“染料摄入测定法”全量细胞病变抑制测定法 、常规微量细胞病变抑制测定法 、微量快速检测法（一步快速法),实验材料,待测标本：本室制备的动物干扰素 测定细胞：人喉癌上皮细胞（Hep-2） 攻击病毒：100TCID50 VSV 其它材料：DMEM 液、VTP 、小牛血清、双抗、40孔细胞培养板、微量移液器、tip头、10ml吸管等实验步骤,稀释待检干扰素：待测干扰素先作稀释后，然后在40孔板中作倍比稀释 微量单层细胞培养 ：按传代细胞的方法制备4×105/ml的Hep-2细胞悬液，由低稀释度向高稀释度的顺序向上述各孔加100 μl细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱中培养24h，形成良好的单层三、中和试验（一）,（7组做此实验）,—稀释血清固定病毒法,实验目的,测定血清中的VSV中和抗体效价,实验原理,特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必须有一定效价的中和抗体 根据稀释成分不同可分为两种方法一为固定病毒用量（100TCID50）与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试验，以血清中和抗体滴度表示。

二为固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验结果以中和指数表示实验材料,VSV免疫动物血清：S1、S2 100TCID50 VSV病毒悬液 稀释液、40孔平底细胞板、Hep-2细胞一瓶、吸管、加样器等实验步骤（1）,1、40孔板每孔加稀释液（DMEM）50μl，作好标记每块板做2个血清标本：S1、S22、取灭活血清，第一孔加入50μl，吹吸三次后吸出50μl加入第二孔，吹吸三次吸出50μl加入第三孔，依次直至第八孔，吸出50μl弃去第九孔细胞对照，第十孔病毒对照均不加血清稀释血清,血清S1,稀释液,管号,,,,,,,,,,,,,,,,稀释度,弃0.05ml,100TCID50 VSV,S2操作同上,Hep-2细胞,3、预先配好100TCID50 VSV病毒悬液，按照每孔50μl加入， C对照（即第9孔）不加病毒，V对照加100 TCID50 50μl最后每孔总量200μl 4、37℃ 作用1小时实验步骤（2）,5、利用此1小时制备Hep-2细胞悬液并加入上述混合液中 Hep-2一瓶，PBS洗涤二次 VTP 1ml消化 约5min后倾去 37℃至细胞从玻璃瓶脱落 加营养液6ml，细胞计数，成1×106/ml，每孔加100μl细胞悬液。

37℃ CO2孵育，次日（24h）观察结果实验步骤（3）,,,,,实验报告,鸡胚原代成纤维细胞的制备 VSV的增殖 Hep-2细胞的传代 VSV TCID50滴定 干扰素（IFN）效价测定/中和试验2013.1.25前交619房间，13818092682,。