M5纤维类组织RNA快速提取试剂盒.doc

M5纤维类组织RNA快速提取试剂盒 使用说明书产品名称单位货号M5纤维类组织RNA快速提取试剂盒50TMF168-05【储存条件】1） 所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在 37C水浴加热几分钟，即可恢复澄清2） 不合适的储存于低温（4C或者-20C）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（ 15 C-25C）进行3） 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入0.25ml （ 20次）和0.5ml （ 50次）RNase・freeH2O溶解因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后可立即按照每次使用量分装冻存， -20 C保存4） 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、 PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子产品简介】独特的裂解液/0毓基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后 ,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗一离心的步骤 ，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物， 蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase freeH2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特色】1） 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好2） 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤孑JK 13） 快速，简捷，单个样品操作一般可在 30分钟内完成4） 多次柱漂洗确保高纯度， OD260/OD 280典型的比值达1.9-2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR , Northern-blot和各种实验产品组份】50T注意事项裂解液RLT50 ml室温密闭干燥保存去蛋白液RW140 ml室温密闭干燥保存漂洗液RW10 ml初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇RNase-Free H 2O40 ml室温密闭干燥保存蛋白酶K粉末20mg・20度RNase-Free吸附套管50套室潟索闭干燥保存【注意事项】1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000 rpm的传统台式离心机，女口 Eppendorf 5415C 或者类似离心机2. 需要自备乙醇， &疏基乙醇，一次性注射器，研钵，水浴锅等3. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服若沾染皮肤、眼睛时， 要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4. 预防RNase污染，应注意以下几方面：1） 经常更换新手套因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase污染2） 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染3） RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase的塑料和玻璃器皿 玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料器皿可在 0.5 M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase4） 配制溶液应使用无 RNase的水将水加入到干净的玻璃瓶中， 加入DEPC至终浓度0.1%（v/v） ,37C放置过夜，高压灭菌5. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总 RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA的微量残留，本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数 RT-PCR扩增过程中极其微量的 DNA残留（一般电泳 EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大 ，如果要进行严格的 mRNA表达量分析如荧光定量 PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：1） 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2） 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对3） 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理本试剂盒还可以用于 DNase I处理后的RNA清洁（cleanup）,请联系我们索取 具体操作说明书4） 在步骤去蛋白液 RW1漂洗前，直接在吸附柱 RA上进行DNase I处理请联系我们索取具体操作说明书6. RNA纯度及浓度检测:完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度 1.2% ； 0.5xTBE电泳缓冲液；150v , 15分钟）检测完整性由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的 rRNA条带动物rRNA大小分别约为5 kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解纯度：OD260/OD 280比值是衡量蛋白质污染程度的指标高质量的 RNA, OD260/OD280读数（WmMTris, pH7.5 ）在1.8-2.1之间OD260/OD 280读数受测定所用溶液的 pH值影响。

同一个RNA样品，假定在10mMTris , pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9之间，但这并不表示 RNA不纯浓度：取一定量的 RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260, OD280测定，按照以下公式进行 RNA浓度的计算：终浓度（ng/“）1 = （OD260）x （稀释倍数n）x40o【操作步骤】 提示：=J中加入10//I ■毓基乙醇此裂解液最好现用现配配好第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!操作前在裂解液RLT中加入金硫基乙醇至终浓度1%,如4 ml RLT 的RLT4C可放置一个月充分破碎匀浆（非常重要，否则严重降低产量）a・电动破碎匀浆（首选强烈推荐，产量最高结果最稳定） :取约10-20mg （ <30mg ）新鲜组织，加入300“1裂解液RLT后用电动刀片 匀浆机（Rotor-Stator如TissueRupter ）或者电动玻珠研磨机（Bead Mill如TissueLyser ）按照机器使用说明彻底破碎匀浆组织细 胞。

b. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后， 取适量组织细粉10-20mg （ <30mg ）转入装有300“1裂解液RLT的1.5ml离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解用带钝针头的一次性 1 ml（配0.9mm针头）注射器抽打裂解物 10次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒），可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量讲匀浆转入新离心管c. 研钵研磨匀浆： 取适量组织细粉10-20mg （<30mg ）放入小研钵后，迅速加入 300“ 1裂解液RLT后直接室温充分研磨匀浆将匀浆转入新离心管注意：如果匀浆沾在研钵内损失比较大，可以按照比例适当提高起始组织用量和裂解液 RLT用量此外，也可以先用液氮研磨组织成细粉，然后液氮刚刚蒸发完的时候加入裂解液 RLT充分研磨匀浆，可以提高研磨效果2•吸取590/^ I RNase-free H 20至匀浆中加入10/zl蛋白酶K,移液器吹打混匀3. 55 C下水浴10分钟4•室温下以13, OOOrpm离心5分钟这样将会形成小量的组织碎片沉淀，而且在上清的顶部可能看见少量的漂浮物5.转移上清至一个新的1.5ml离心管中注意：转移时不要带入沉淀物，而且移液枪头必须放在上清漂浮物之下。

漂浮物通常可能会黏附在枪头的外壁，注意不能将其带入离 心管中6•较精确估计裂解物（上清）体积，加入0.5体积的无水乙醇（一般为 450“ 1）,此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混 匀，不要离心7•立刻将混合物（每次小于700“ 1,可以分两次加入）加入同一个吸附柱 RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉 废液8•加700〃 I去蛋白液RW1 ,室温放置30秒，12, OOOrpm 离心30秒，弃掉废液如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心9 •加入500/zl漂洗液RW（请先检查是否己加入无水乙醇 !） , 12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液加入500/H漂洗液RW ,,重复一遍10.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应X.取出吸附柱 RA,放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加 30-50 /z I RNase free water （事先在70-90 C水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

12.可选：使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍 （如果需要RNA浓度高）洗脱两遍的RNA洗脱液RNA浓度可以适当提高一些 如果预期RNA产量>30 /z g , W 30-50/z I RNase free water 重复步骤11, 合并两次洗脱液，可以提高产量 15-30%,但浓度会有所降低备注】本产品仅供科研使用在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。