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第二军医大学 硕士学位论文 HIV-1 Tat核心碱性区随机突变组合文库的构建及亲和筛选 姓名：庞强 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：潘卫;戚中田 20100501 H I V - 1T a t 核心碱性区随机突变组合文库的构建及亲和筛选 中文摘要中又摘要 人类免疫缺陷病毒( H u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，H I V ) 归属于逆转录病毒科 中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综 合症( A c q u i r e dI m m u n eD e f i c i e n c yS y n d r o m e ，A I D S ) ，即艾滋病目前，艾滋病感 染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题研制有效的H I V 疫苗是艾滋病防治的 重要手段之一因此，探索H I V 疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成 功研发显得尤为重要 H I V - 1 反式激活蛋白( T r a l l s ．a c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ，T a t ) 是H I V 感染早期产生的 一种重要调控蛋白，在H I V - 1 的复制、扩散和致病中起重要作用。

H I V o l 感染靶细胞 后，胞质中合成的T a t 转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体 ( t r a n s c r i p t i o ni n i t i a t i o nc o m p l e x ，T I C ) ，促进病毒R N A 的转录、延伸和病毒复制【l J 此外，T a t 还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“病毒毒素”的作用：①通过 诱导C D 4 + T 细胞、N K 细胞或B 细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用【2 ，3 ，4 ，5 ，6 】：②通 过J A K ／S T A T 信号转导途经激活H H V ．8 的复制，或通过R G D ( A r g —G l y ．A s p ) 与内皮细 胞0 L v p 3 和a 5 p ，整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波氏肉瘤 ( K a p o s i ’Ss a r c o m a , K S ) 的形成p 芦J ；③通过影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶 质细胞表达T G F ．p 、T N F 等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发 生[ 9 , 1 0 , 1I ] 。

T a t 碱性氨基酸富集区( 4 9 —5 7 a a ) 是T a t 的穿膜和核定位功能基序，是T a t 蛋白的 主要中和表位之一其中和抗体可消除T a t 分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核 心功能【l2 1 此外，T a t 碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广 的抗体已有研究表明，构建T a t 5 l 位、5 5 位定点突变后，碱性区表位未被破坏，且 T a t 穿膜活性和胞外活性被大大减弱I l3 因此本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化 平台，对天然T a t 碱性区进行重组改造和筛选，为保证T a t 碱性区表位的完整性，我 们保留了T a t 核心区( 3 8 ．4 8 a a ) ，构建由核心碱性区突变片段经随机连接肽相互连接 的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性T a t 抗体的兔抗血清进行亲和筛选， 以期获得一系列碱性区表位构象稳定，而生物活性明显降低的突变体序列，为新型 T a t 疫苗的研发做基础研究 第二军医大学硕士学位论文 本研究分以下三部分进行： 一、H I V - IP E T 3 2 a ．T a t 3 s - 6 l 蛋白的表达及免疫反应性鉴定 功能研究表明：T a t 蛋白核心区( 3 8 - 4 8 a a ) 可与旁观未感染细胞的微管蛋白结合 引发细胞凋亡f 1 4 1 ；T a t 蛋白碱性区( 4 9 ．5 7 a a ) 介导T a t 蛋白穿膜，与T a t 细胞外活性 密切相关‘1 4 , 1 5 】。

结构研究表明【1 6 】：T a t 分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型 的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快速动态的变 化之中，导致以T a t 作为抗原，刺激效果差，高亲和力的抗体较少且容易被降解因 此，T a t 核心碱性区重要表位是否能够得到保留是噬菌体突变文库亲和筛选的基础 为此，我们首先将T a t 的核心碱性区3 8 ．6 1 a a 构建到原核表达载体，纯化出 P E T 3 2 a - T a t 3 8 ．6 l 蛋白，并通过含有T a t 抗体的阳性血清对其进行免疫反应性鉴定 根据大肠杆菌偏好密码子优化后的I I I V - 1 型H X B 2 株T a tD N A 序列设计引物， 用P C R 方法合成H I V - 1t a t 3 8 - 6 l 序列，T ／A 克隆法将其克隆到p M D l 8 ．T 载体进行测序 将测序正确的t a t 3 8 ．6 l 克隆至原核表达载体p E T 3 2 a ，构建其原核表达质粒p E T 3 2 a - t a t 3 8 - 6 1 将表达质粒转入E ．c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) 中，I P T G 诱导表达出相对分子量为2 1 3 0 0 的 融合蛋白，并用N i - N T A 亲和层析法纯化P E T 3 2 a - T a t 3 8 - 6 l 蛋白。

分别用本实验室制备 的兔抗P E P T I D E ．T a t l ．1 0 l 血清和上海市公共卫生中心提供的H I V 阳性血清进行 E L I S A 检测，鉴定P E T 3 2 a - T a t 3 8 ．6 I 蛋白的免疫反应性结果显示：( D P E T 3 2 a ．T a t 3 8 - 6 1 与兔抗P E P T I D E ．T a t I ．1 0 l 血清【1 7 1 呈特异性反应，且反应强度低于阳性对照蛋白 P E T 3 2 a ．T a t l ．1 0 l ，载体蛋白P E T 3 2 a 有微弱反应②在1 2 例H I V 阳性血清中，有4 例 与P E T 3 2 a - T a t 3 8 _ 6 l 有明确的特异性反应，有6 例与阳性对照全长蛋白P E T 3 2 a - T a t l ．1 0 l 呈特异性反应，并且包含了全部4 例与P E T 3 2 a - T a t 3 8 - 6 l 呈特异性反应的H I V 血清 以上E L I S A 测定结果说明P E T 3 2 a ．T a t 3 s - 6 I 蛋白较好地保留了T a t 碱性区表位。

综上所述，我们成功构建并表达出P E T 3 2 a - T a t 3 8 - 6 l 蛋白，并通过E L I S A 鉴定其 免疫反应性，结果显示含T a t 抗体的血清与P E T 3 2 a ．T a t 3 8 ．6 l 融合蛋白呈特异性反应， 说明P E T 3 2 a - T a t 3 8 - 6 l 蛋白碱性区重要表位得到保留，为进一步制备针对核心碱性区的 中和抗体以及随机突变文库的亲和筛选奠定基础 二、H I V - 1T a t 核心碱性区随机突变组合文库的构建 研究表明，碱性区两个重要的位点5 1 K 和5 5 R 定点突变后，对该表位无破坏， 且T a t 穿膜活性和胞外活性被大大减弱因此，为了获得一系列碱性区表位构象稳定， 而生物活性明显降低的突变体，我们首先构建了针对T a t 碱性区的突变体文库通过 H I V - 1T a t 核心虢} 生区随机突变组合文库的构建及亲和筛选 采用含随机核苷酸序列的引物， O v e r l a pP C R 方法对碱性区两个位点5 1 K 和5 5 R 进 行了随机突变，使之转变成5 1 X 和5 5 1 X 此外，构建适合的大容量生物大分子变异 体文库是进行体外分子进化研究的关键。

因此，为了扩大碱性区基因序列中被筛选的 范围，同时在碱性区6 l 位后引入6 个随机连接肽X 6 ，以期扩大文库的重组子，并利 用随机连接肽可与碱性区表位序列之间相互作用，稳定展示表位的构象 经过四轮P C R 得到t a t 3 8 ．6 1 ( 51 X ／5 5 X ) 突变体片段，通过X b aI 酶切后，克隆至 噬菌体展示载体p C A N T A B 5 S 上，转化超级感受态T G l 细胞，建立H I V - 1T a t 核心碱 性区( T C B R ) 随机突变组合文库辅助噬菌体M 1 3 K 0 7 拯救后，得到T C B R 随机突 变噬菌体原代展示文库所得到的噬菌体展示文库的库容量为5 ．0 x1 0 6 ，滴度为2 ．6 5 1 0 1 2T U ／m l ，片段插入率为7 0 ％对2 4 个T C B R 随机突变组合文库的重组子进行 序列测定，结果显示文库中突变体片段的重要突变点位5 l 位、5 5 位两个位点的核苷 酸序列与氨基酸序列呈随机排列，无明显偏向性 综上所述，我们成功构建了H I V - 1T a t 核心碱性区随机突变组合文库，并且其库 容、多样性、随机性均达到文库构建要求，为后续用含有高中和活性的抗T a t 兔抗血 清进行亲和筛选奠定了基础。

三、H I V - 1T a t 核心碱性区随机突变组合文库的亲和筛选 通过第一部分的鉴定，我们发现碱性区肽段可以较好的保留其中和表位，我们用 两种兔抗血清：兔抗P E T 3 2 a - T a t I ．1 0 l 和兔抗P E T 3 2 a - T a t 3 8 ．1 0 l ，同时对T C B R 随机突变 组合文库进行亲和筛选，以期获得亲和力更强，穿膜活性更低新型免疫原的代表性序 列通过两种兔抗血清同时对文库进行两轮筛选，每轮结束后，挑取单克隆进行P C R 鉴定，并对P C R 鉴定过的阳性克隆进行序列分析 两种T a t 兔抗血清对T C B R 文库两轮筛选后重组子P C R 鉴定结果显示：( 堇) T C B R 文库中突变片段的插入率由7 0 ％上升到9 0 ％左右，说明与T a t 抗体亲和高的突变体片 段通过筛选得到有效富集；②包含2 个突变片段的重组子在文库中所占的比例显著下 降，而包含单个突变片段的重组子在文库中所占的比例由筛选前的5 5 ％上升到9 0 ％ 左右理论上，通过连接肽串联重复多个突变体片段形成的大分子多肽，由于亲和力 的关系，抗原表位重复次数多具有选择性优势，容易被进化筛选获得。

但两轮筛选后 突变体片段结构的变化，似乎说明突变体片段的重要突变位点5 l 位、5 5 位的突变情 况较大分子多肽对优势抗原表位的富集具有更重要的作用 两种T a t 兔抗血清对T C B R 文库每轮筛选后，对4 0 个重组子进行序列测定，结 果显示：q ) 5 1 位碱性氨基酸得到富集，这与理论相符，天然T a t5 1 位为赖氨酸( K ) ； ②5 1 位、5 5 位都出现特征性氨基酸脯氨酸( P ) 一项日本实验研究结果似乎说明5 1 第二军医大学硕士学位论文 位突变成P 更有利于T a t 穿膜【1 8 J ，这与本实验的目的截然相反，但出现了相同的特征 性氨基酸，这种联系还需要进一步的研究似乎脯氨酸本身结构更容易稳定表位的空 间构象③5 1 S ．5 5 P 可作为一个有意义的候选特征序列，进一步研究另有一项法国 实验研究表明，将T a t 碱性区的5 1 位赖氨酸( K ) 定点突变成苏氨酸( T ) ，5 5 位精 氨酸( R ) 定点突变成亮氨酸( L ) ，构成突变体“S T L AT a t ”，其反式激活活性消除， 胞外毒性大。