免疫测定技术的最新应用和发展趋势――访李金明教授.doc

免疫测定技术的最新应用和发展趋势——访李金明教授访谈前言：李金明教授，卫生部临床检验中心临床免疫室主任，研究员，负责全国医院和血站实验室感染性疾病临床免疫学和PCR检验以及自身抗体免疫检验室间质量评价工作，并从事相关方面的研究，研究方向为临床分子诊断方法及标准化本期《临床实验室》的主题为免疫，广大读者希望利李教授能将工作与研究中的经验与心得与我们分享，更好的推动免疫测定技术的临床应用与发展《临床实验室》：李主任, 您好！您是国内临床免疫检验方面的权威专家，本期临床实验室杂志的专题是免疫，非常荣幸邀请您作为我们本期专家访谈的嘉宾，进行关于免疫测定技术的最新应用和发展趋势的讨论首先请您介绍一下免疫检验的发展历程李教授：众所周知，现代免疫学的发展与微生物学尤其是细菌学是密不可分的，临床免疫测定技术的发展亦是如此临床免疫检验技术的出现最早可追溯至十九世纪末1896年，Widal发现在一定浓度的伤寒杆菌中加入伤寒病人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早的用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验（Widal test）该试验出现后，一百多年来一直用于临床检验。

稍后，1897年Kraus又发现将细菌培养液与其相应的抗血清混合后可发生肉眼可见的沉淀反应，于是，免疫沉淀试验又应运而生到1900年，维也纳大学病理解剖系的年仅32岁的助教Landsteiner发现一些人的血浆能使另一些人的红细胞凝集，这种同种凝集现象的发现，成为人类血型分类的基础，并由此而衍生了生物科学中的一个特殊分支即免疫血液学，Landsteiner也因人类血型的发现获得了1930年的诺贝尔生理学或医学奖并且，直至今天，我们仍然在使用基本的红细胞凝集试验鉴定ABO血型在同一年代，Bordet又发现了补体结合试验（Complement fixation test, CFT），即抗原抗体反应后具有补体结合的能力，如红细胞与溶血素反应后，如有补体存在即可出现溶血现象因此，利用这种免疫溶血机制做指示系统，可以检测另一反应系统中抗原或抗体的存在与否1906年Wassermann将这种试验用于梅毒螺旋体感染的诊断，建立了著名的用于梅毒血清学诊断的华氏反应免疫沉淀和免疫凝集试验属于经典的免疫测定技术，现在仍常用的免疫沉淀试验有单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验、免疫电泳、免疫固定电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫透射比浊、免疫散射比浊、免疫胶乳增强比浊等；常用免疫凝集试验有间接血凝试验、胶乳凝集试验和明胶颗粒凝集试验等。

标记免疫测定技术标志着免疫测定技术进入到了高灵敏免疫测定的时代1941年Coons等建立的荧光抗体技术（Fluorescent antibody technique）为定位组织和细胞中的抗原物质提供了一个直接而又有效的手段在20世纪40年代以前，所出现免疫测定技术基本上都是定性或半定量测定方法，到50年代末60年代初，才出现完全的定量测定方法，即放射免疫试验(Radioimmnuoassay, RIA)1960年，纽约退伍军人医院（the Veterans Administration Hospital）的Berson 和Yalow发表了内源性血浆胰岛素测定的RIA方法高灵敏放免测定技术的出现，解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题，其发明者之一Yalow 因此而获得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖，Berson因为1972年就已去世，所以没能与Yalow一起分享这个荣誉尽管放免测定技术的出现是免疫测定技术发展史上的一个里程碑，但由于其有试剂半衰期短，实验废液难以处理，污染环境等缺点，使得其现已逐步退出在临床常规检验中的应用，而采用非同位素标记物建立标记免疫测定技术成为发展主流。

1966年，法国巴斯德研究所的Avrameas和Uriel以及美国的Nakane和Pierce同时报道了酶免疫测定技术其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位，可通过光学显微镜和电子显微镜来观察并且Avrameas报道了将酶通过戊二醛方法标记抗原和抗体的理想条件60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann、荷兰Organon公司的VanWeeman和Schuurs等以及法国巴斯德研究所的Avrameas等同时发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)Engvall和Perlmann以碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）作为标记物，建立兔血清IgG的定量ELISA测定方法VanWeeman和Schuurs则以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作为标记物，建立定量检测人尿中hCG的ELISA方法Avrameas等以酶标记抗原建立了血清IgG测定方法这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。

其后，1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(Homogeneous)酶免疫测定技术—酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)，这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用随着70年代中期杂交瘤技术的发展，出现了单克隆抗体，其应用于免疫测定，极大地提高了免疫测定的灵敏度和特异性，且为不同免疫测定方法的设计提供了广阔的想象空间，各种免疫测定技术相继出现，如一步法双抗体夹心酶免疫测定，各种均相酶标或同位素标记免疫测定方法等到了80年代，研究人员又发现胶体金可以作为抗体的标记物，建立简便快速的免疫渗滤层析试验，即所谓的金标试纸条进入90年代，基于不同测定原理不同标记物（酶、发光物、元素化合物等）的各种自动化免疫分析仪，不断应用于临床检验，给我们实验室的日常工作，不但带来了很大的便利，而且其测定较之人工操作更为稳定和准确自上世纪90年代以来，基因工程免疫测定试剂和基因工程抗体的发展，又一次拓宽了免疫测定技术的发展途径综观免疫测定技术一百多年的发展历程，可以看出，这种建立在抗原和抗体特异相互作用基础上的临床检验技术，已成为我们认识了解生命未知物质的一个难以替代的手段，其发展的每一步都来自于相关学科研究认识的深入。

如果说抗原和抗体特异相互作用，只是免疫测定技术的基本框架，那么标记物、单克隆抗体、固相支持物等等就像是这个框架上最丰富多彩的外装《临床实验室》：相对于临床来说，常用的免疫检验项目与临床意义都有哪些？李教授：常用的临床免疫检验项目主要可分为：（1）病原体抗原和抗体如乙肝“两对半”（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）、梅毒抗体、风疹病毒抗体（IgM、IgG）、弓形虫抗体（IgM、IgG）、巨细胞病毒抗体（IgM、IgG）、单纯疱疹病毒抗体（IgM、IgG）等2）肿瘤标志如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）、CA19-9、CA125、CA15-3、CA50、CA72-4、CA242、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽特异抗原（TPS）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）等3）特定蛋白如C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白及亚类、补体C3和C4、抗链球溶血素O(ASO)、类风湿因子(RF)、前白蛋白(Prealbumin)、白蛋白(Albumin)、微白蛋白(Microalbumin)β2微球蛋白(β2Microglobulin)、α1抗胰蛋白酶 (α1AT)、铜蓝蛋白(Caeruloplasmin)、结合珠蛋白(Haptoglobin)、转铁蛋白 (Transferrin)、载脂蛋白A（APO-A1）、载脂蛋白B（APO-B）等。

4）激素T3、T4、促甲状腺激素（TSH）、皮质醇（Cortisol）、卵泡刺激激素（FSH）、促黄体激素（LH）、孕酮、泌乳素（PRL）、睾酮、雌二醇、C-肽、胰岛素、肾上腺激素等5）自身抗体如类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗ENA抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体、抗线粒体抗体、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体（cANCA/pANCA）、抗甲状腺球蛋白抗体等其他还有治疗药物监测（地高辛、苯妥英、茶碱、丙戊酸、卡马西平等）、肌钙蛋白等在临床意义上，病原体抗原和抗体的检测主要是用于判断相应病原体的感染状态（急性或慢性感染、病原体携带等），一些如抗-HBs可用于疫苗免疫效果的判断肿瘤标志由于没有很好的器官特异性，主要用于恶性肿瘤的治疗疗效、复发监测，一般不能用于健康体检肿瘤筛查和诊断，只有个别的项目如AFP、PSA可用于高危人群的健康体检特定蛋白为血液中具有多种功能的蛋白，如载体蛋白、免疫球蛋白（抗体）、酶、凝血因子等，其含量变化通常与多种疾病有密切关系如CRP是急性时相反应的一个极为灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。

结合临床病史，有助于随访病程有研究认为，CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素，其危险程度是血液中过量胆固醇的2倍CRP含量高的人患高血压的危险率比胆固醇高的人大1倍如果炎症和过高的胆固醇同时出现的话，那么患心脏病和中风的危险率比正常的人要高出9倍由此可见，CRP含量高和患心脏病呈正相关此外有研究发现，血中高浓度的CRP是结肠癌发病的危险因素，并认为CRP可能是结肠癌的一个早期标志物免疫球蛋白及其亚类浓度在不同年龄段有所差异，在某些疾病情况下，如慢性肝病、亚急性或慢性感染、结缔组织疾病、ＩｇＧ骨髓瘤、无症状性单克隆ＩｇＧ病、遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性ＩｇＧ缺乏症，蛋白丢失性肠病、肾病综合症、强直性肌营养不良，免疫抑制剂治疗儿童常见的反复呼吸道感染、经常腹泻、发育迟缓等症状以及经常发生的许多呼吸道疾病如中耳炎、鼻窦炎、肺炎、气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张以及哮喘等，这些指标的浓度将出现升高或降低，从而具有疾病诊断价值补体含量下降并不一定代表免疫功能障碍或免疫缺陷，因为在缺血、凝固性坏死和中毒性坏死时，组织能释放较多的蛋白分解酶，导致补体溶血活度和补体组分的下降；血补体浓度升高，常见于各种炎症性疾病及阻塞性黄疸、急性心肌梗塞、溃疡性结肠炎、糖尿病、急性痛风、亚急性和急性甲状腺炎、急性风湿热、皮肌炎、多发性肌炎；混合性结缔组织病；结节性动脉周围炎等。

其他特定蛋白的临床意义可参考相应专业书籍激素测定中不同的激素指标则用于各种内分泌疾病的辅助诊断如T3、T4和TSH用于甲状腺功能的辅助诊断；LH、FSH和TSH用于判断下丘脑-垂体-性腺轴功能；泌乳素升高则与垂体泌乳素瘤、垂体生长激素瘤、原发性肾上腺和甲状腺功能减退、肝病等有关，降低则与垂体前叶功能减退有关其他激素测定的临床意义可参考相应专业书籍自身抗体检测主要是用于自身免疫病诊断、疾病状态判断和疗效监测《临床实验室》：现在广大临床工作者对免疫检验项目正常值的设立和质控存在疑惑，您对此有何见解？李教授：正常值又称“参考范围”，这个概念属于定量测定范畴长期以来，我国临床定量测定（包括定量免疫测定）所使用的“参考范围”基本上源于国外教科书，是非黄种人的数据，从严格意义上说不适合于中国人群，但长期以来的使用并没出现大的问题，原因可能有两个：（1）绝大部分指标的“参考范围”在不同人种间的差异不大，再加上较大的“参考范围”，不会影响到临床医疗实践中临床医生的决策。