实验一大肠杆菌DNA的提取[修改版].docx

第一篇：实验一大肠杆菌NA的提取（写写帮推荐）大肠杆菌总DNA的提取实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到 的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法实验材料：1. 实验菌株：大肠杆菌2. 试剂：TE 溶液：Tris・HCI 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：溶菌酶（50mg/mI）5M NaCI氯仿：异戊醇（24： 1 v/v）无水乙醇0.8%琼脂糖TAE 电泳缓冲液 仪器：离心机，电泳仪 实验步骤：1）取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；2）加入500uI TE 溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；3）用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul溶菌酶（50mg/ml），37° C保温30min； 4）加入40ul 20 %SDS 使其终浓度为2 %，60° C水浴30min5）加入110ul 5 M高氯酸钠 使其终浓度为1 M,充分混匀；6）加入等体积氯仿：异戊醇（24： 1 v/v）,充分混匀，4° C 12,000 rpm离心15min，吸取上清于一新 离心管中；刀加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm离心10min； 8）弃上清，离心管在空气中自然晾干;9） 加入 30-40ul TE 溶解 DNA；10）取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。

第二篇：实验四植物DNA的提取/定稿J实验四植物 DNA 的提取一、 实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行 纯度分析二、 实验原理1、 核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在核 酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存 在于细胞质及核仁里在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来在浓氯化钠溶液(1〜2 mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化 钠溶液(0.14 mol / L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大因此，可利用不同浓度的氯 化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质 除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去 变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相用两倍体积的无水乙醇溶 液将DNA钠盐沉淀出来。

如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA②用十二烷基硫酸钠(SDS) 等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA③用苯酚处理，然后离心分层，DNA 溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维 状DNA沉淀反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的 DNA制品为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理生物材料中含有的脂肪物质和大部分 的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构 在pH值4.0〜11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱②物理 因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会 令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破 坏时被释放出来，它会降解DNA分子故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活操作过程最好在低温｛0°C左 右)下进行。

常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等SDS和苯酚作 为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活2、 CTAB法和SDS法的提取原理(1)CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离 子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸CTAB复合物，这种复合物溶于高盐 缓冲液(20.7M NaCl),降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB- 核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加 入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿一异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离 心得到 DNA2) SDS法也是提取植物DNA的常用方法先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然 后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转 变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全3、DNA的浓度测定和纯度分析(1) 定磷法：是对样品中核酸(DNA和RNA)含量的准确定量。

将样品中的核酸用强酸(硫酸或高氯 酸)消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能 与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有 最大光吸收2) 紫外光吸收法:核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm°1ug/mL的DNA溶液A260=0.020,1ug/mL 的 RNA 溶液或单链 DNA 的 A260=0.022~0.0241 个 A260 相当于 50ug/mL 的 DNA、40ug/mL 的 RNA蛋白 质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的 A260/A280 在 2.0 左右三、 试剂和器材：⑴1M Tris-cl (pH8.0)： Tris I21.1g溶于蒸馏水，用浓HCI调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml (2) CTAB分 离缓冲液：2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O, 10mL 1mol/L 的 Tris-HCL(pH8.0), 0.2mL 巯基乙醇， 加水定容到 100mL。

3) 洗涤缓冲液(70%乙醇，10mmol/L乙酸铵)：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL4) TE 缓冲液： 10mmol/L Tris-HCL(pH7.4)， 1mmol/L EDTA (5) 氯仿:异戊醇=24:1 (6) 液氮(7)研钵，恒温水浴(37〜100°C),离心机，离心管四、 操作方法：(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65C水浴中预热2)称取1.5g叶片，置于预 冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动 使之混匀4) 样品于65C保温30分钟，每5〜10分钟混匀一次5)加等体积(10ml)的氯仿一异戊醇，轻轻 颠倒混匀6)室温下4000r/min离心10分钟7) 用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中(注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白 质层)，向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出有些情况下，这一步可以产生云雾 状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜)8)用下述方法 收集 DNA：如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟(不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉)。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀 上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA 沉淀自然干燥20分钟9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟10)将自然干燥的DNA溶于ImLTE缓冲液中，一20°C保存备用11)取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率12)取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以入-DNA/HindIII做分子量标准， 另取 5uL 做限制性酶切注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡五、思考题1、 CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？2、 吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？第三篇：dna提取原理dna 提取原理1. 溶液i—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的B-1,4糖苷键，因而具有溶菌 的作用当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到抑制葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA： (1)螯合Mg2 +、Ca2 +等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需 要一定的金属离子作辅基)；(2) EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离 子强度的环境2. 溶液 ii－NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的但当pH>12或pHV3时，就 会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时，该系统的pH就 高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性SDS：SDS 是离子型表面活性剂它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜2)解聚细胞中的核蛋白3) SDS能与蛋白质结合成为R-0-S03-…氓+-蛋白质的复合物，使 蛋白质变性而沉淀下来但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干 净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰3. 溶液 III—3mol / L NaAc (pH4.8)溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸所 以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。

用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在而高盐的3mol / L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为 钠盐与SDS —蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法乙醇 的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易 于聚合一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右因而也可 改用 95％乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵)但是加95％的乙醇使总体积 增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收。