细菌的革兰氏染色及染色液的配制.docx

革兰氏染色的一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立 未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察染色后细菌 与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴 定革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘 液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染染色后除可以看到细菌形态外，还 可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G书被酒精脱色复 染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因 素有关致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等 属革兰氏染色阳性菌百日咳杆菌、大肠杆菌（大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、 痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性菌所 以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出 诊断又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1） 涂片固定2） 草酸铵结晶紫染1分钟3） 纯化水冲洗4） 加碘液覆盖涂面染1分钟5） 水洗，用吸水纸吸去水分6） 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分7） 番红染色液（稀）染10秒钟后，纯化水冲洗干燥，镜检染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色实验三 细菌的革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状它是1884年由丹麦医师Gram创立的 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染 色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革 兰氏阴性细菌，用G-表示细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结 构不同而造成的革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色 过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫- 碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚 糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使 结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红 色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）； 脱色剂（decoorising agent）和复染液（counterstain）碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染 色的初染液一般是结晶紫（crysta vioet）媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂脱 色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不 能，脱色剂常用95%的酒精（ethano）复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复 染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜 色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； 草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液， 95%乙醇，载玻片，显微镜等四、 操作步骤1 ．涂片将培养 24 小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚）， 干燥、固定固定时通过火焰1〜2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2．染色（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗3） 脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚 不出现紫色时为止，约20〜30 秒钟，立即用水冲净酒精4） 复染：用番红液染1〜2分钟，水洗5） 镜检：干燥后，置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色以分 散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性6） 同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比 注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌此外，菌龄也影响染色结果，如阳 性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应五、 实验结果与讨论微生物染色液的配制一、 吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液A 液：美蓝(methylene blue) 0. 6g95%酒精 30mlB 液： KOH 0. 01g 蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可二、 齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A 液：碱性复红(basic fuchsin) 0. 3g95%酒精 10mlB 液：石炭酸 5. 0g蒸馏水 95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。

将石炭酸溶解于水中，配成B液混合A液及B液即成通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次 不宜多配三、 革兰氏(Gram)染色液1. 草酸铵结晶紫染液A 液：结晶紫(crystal violet) 2g95%酒精 20mlB 液：草酸铵(ammonium oxalate) 0. 8g 蒸馏水 80ml混合A、B二液，静置48小时后使用2. 卢戈氏(Lugo l)碘液碘片 1. 0g 碘化钾 2. 0g蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即 成3.95%的酒精溶液(脱色用)4.番红复染液番红(safranine O) 2. 5g95%酒精 100ml取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成四、 芽孢染色液1. 孔雀绿染液孑 L雀绿(malach ite green) 5g蒸馏水 100ml2．番红水溶液番红 0．5g蒸馏水 100ml3．苯酚品红溶液碱性品红 11g无水酒精 100ml制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用4.黑色素(nigrosin)溶液水溶性黑色素 10g蒸馏水 100ml称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水 到100ml，加0. 5ml甲醛，备用。

五、 荚膜染色液1. 黑色素水溶液黑色素 5g蒸馏水 100ml福尔马林(40%甲醛) 0. 5ml 将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂2. 番红染液与革兰氏染液中番红复染液相同六、 鞭毛染色液A 液：单宁酸 5gFeCl3 1. 5g蒸馏水 100ml福尔马林(15%) 2. 0mlNaOH(1%) 1. 0ml配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用B 液：AgN03 2g蒸馏水 100ml待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓 厚的悬浮液，再继续滴加 NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止再将备用的 10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到 摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重， 则银盐沉淀出，不宜使用七、 富尔根氏核染色液1.席夫氏(Schiff)试剂将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5分钟，冷至50°C左右过滤，再加入 1mol/LHC120ml,摇匀待冷至25C时，加Na2S205(偏重亚硫酸钠)3g,摇匀后装在棕色瓶中， 用黑纸包好，放置暗处过夜，此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用)，再加中性活性炭 过滤，滤液振荡1 分钟后，再过滤，将此滤液置冷暗处备用(注意：过滤需在避光条件下进行)。

在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥，以消除还原性物质2． Schandium 固定液A 液：饱和升汞水溶液50ml 升汞水溶液加 95% 酒精 25ml 混合即得B 液：冰醋酸取A液9毫升+B液1毫升，混匀后加热至60°C3．亚硫酸水溶液10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml, 1mol/LHCl5ml，加蒸馏水100ml混合即得八、 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml福尔马林(40%甲醛) 25ml冰醋酸 5ml1g苦味酸可制成75ml饱和水溶液 先将苦味酸溶解成水溶液，然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成九、 乳酸石炭酸棉蓝染色液石炭酸 10g乳酸(比重 1．21) 10ml甘油 20ml蒸馏水 10ml棉蓝(cottonblue) 0. 02g 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成十、瑞氏(Wright)染色液 瑞氏染料粉末 0. 3g甘油 3ml甲醇 97ml 将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨，先加甘油，后加甲醇，放玻璃瓶中过夜，过滤即可十一、美蓝(Levow it z-Weber)染液在52ml95%酒精和44ml四氯乙烷的三角烧瓶中，慢慢加入0. 6g氯化美蓝(met hylene blue chloride),旋摇三角烧瓶，使其溶解。

放5—10C下，12—24小时，然后加入4ml冰 醋酸用质量好的滤纸如 WhatmanNo. 42 或与之同质量的滤纸过滤贮存于清洁的密闭容器 内图铜绿假单胞菌菌落图片-铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌-显微图片破伤风梭菌大肠杆菌志贺菌革兰染色伤寒沙门菌革兰染色念球菌病直接镜检结核分枝杆菌肉毒杆菌。