ABI-3500 xL基因分析仪操作流程.docx

ABI 3500xL基因分析仪操作流程一、 标准测序反应（一） 质粒测序标准实验流程1．对质粒DNA的质量和浓度要求 纯度：OD 260/OD 280= 1.6~2.0，用量：每反应150~300 ng2．测序 PCR 反应 标准反应体系：3．测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物4）取10 L Hi-Di Formamide加入96孔板中，再加入10 L待测样品，振荡混匀离心二） PCR 产物测序标准实验流程1． 对PCR 产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100 ng强烈建议在测序前，先纯化PCR产物2． PCR产物的测序 PCR 反应标准反应体系：3． 测序产物纯化：方法同上二、 上机测序（一）启动系统1. 打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动2. 打开3500 xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成3. 启动电脑桌面Data collection software。

4. 检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击5. 检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续6. 仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子3. 按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者三）创建平板1. 点击Create Plate From Template，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer一般详细如下1. 点击屏幕下方的Assign Plate Contents1） 输入各个孔的样品名称等信息，Results group：输入结果的保存路径。

2） 选中下面控制面板上Assay，Filename convention，Results group三个项目3） 点击Link Plate for Run→OK2. 检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击Start Run，即启动运行四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况1. 可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看Instrument Run Views and Flags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图2. 可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作3. 启动、暂停或继续运行五）查看结果点击Review Results即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下三、 分析测序结果1. 打开软件：双击电脑桌面Sequencing Analysis v5.4图标2. 导入结果：点击工具栏中Add samples 按钮，选择路径，导入待分析的测序结果3. 分析：Sample manager中选择分析方法对测序结果进行分析一般用BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列)1） 选中BC复选框，点击工具栏中Start analysis 按钮，即开始分析。

2） 分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件3） 点击工具栏中Analysis report 按钮，可查看结果状态(BC status)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否4） 选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果A． sequence显示碱基序列及其QV评分结果注意：a. 蓝色：High QV = 20+，结果可信；黄色Medium QV = 15 to 19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色Low QV≤15，结果不可信b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中B． Electropherogram显示电泳峰图及序列C． Raw显示看到原始电泳图4. 打印：Sample manager中选中P (print)复选框，点击Start analysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档操作注意事项1. 测序反应：（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠3）反应条件：退火50℃和延伸60℃时，升降温速度需降低至1℃/s，使测序反应充分进行。

4）体系配制：反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染ABI 3500xl日常维护1. 毛细管维护：（1）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下下次电泳前换新的缓冲液2）防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软件中重新校正包括：A空间校正，maintainance→calibrate→speitial，选择fill灌胶后开始，选择no fill不灌胶直接开始→start calibrate结果判定，所有峰只有一个尖且间距在15，16间，峰高比较均一，相差不超过60%，可接受，完成后要点Accept或者rejectB光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainance→calibrate→spectial，G5为片段分析用，Z为测序用→calibrate run，chemistry standard：G5完成后需点Accept3）若长期不用仪器时，仍需每周给毛细管灌胶一次fill array with polymer）2. 仪器日常维护：（1）可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面，勿使用有机溶剂，不能随意搬动仪器。

（2）严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用U盘拷贝数据，只能刻盘3）长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4℃冰箱，用漂洗袋代替并每周进行一次replenish polymer换新胶袋后和每周一次）4）若机器使用频繁应每周用contridationing regents清洗灌胶泵(wash pump and channels)一次5）fill array with polymer，换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌6）shut down ，长期不用时关闭仪器，慎用7）remove bubbles，排气泡8）灌胶泵维护每月一次：A，水峰，松开泵上方进口旋钮，用注射器注射纯水5-10ml，要缓慢注射，洗去水峰中的杂质，结晶B，拆掉buffer，胶时可手动洗泵，从泵下方进胶处注射入纯水，也可contridationing regents洗泵4. 操作注意：（1）操作时必须戴手套2）Hi-Di Formamide为变性剂，操作时需注意安全3）仪器运行时不能打开仓门，软件运行时勿进行其他软件的操作。