
RNAi的实验设计及使用步骤.docx
11页RNAi的实验设计及使用步骤RNA干扰(RNA interfenng , RNAi )现象是由与靶基因序列同源的双链 RNA ( double-stranded RNA , dsRNA )引发的广泛存在于生物体内的序列特异性 基因转录后的沉默过程.细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的,dsRNA特异 性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21・25个核甘酸组成的小干扰RNA(small interfenng RNA , siRNA),随后siRNA作为介寻子引起特异性地降解相同序列的 niRNA ,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.B. RNAi实验流程靶基因确状 (Target Gene Identification)siRNA设计CsiRMA Design)siRNA的规备(siRNA Generation)功能研究(Function Research)RNAI结果检测 1/ f(Measure Knockdown)匕 HsiRNA的转染(siRNA Transfection)siRNA设计A.哺乳动物siRNA设计基因抑制的有效性很大程度取决于目的基 因序列的选择.目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试 不同的序列以决定何种序列是最有效的.哺乳动物siRNA设计需要注意的几个 方面1 .从转录本(mRNA )的AUG起始密码开始,寻找“AA〞二连序列,并记 下其31端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点.正义链和反义链都采 用这19个碱基(不包括AA重复)来设计.2 .防止在起始密码子或无义区域附 近选择目的序列.3 . siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右.4 .在设计 siRNA时不要针对5和3端的非编码区(untranslatedregions , UTRs ),原因是 这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者译起始复合 物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果. 5.将挑选的序列在公共数据库中进行比拟以保证目的序列与其它基因没有同源 性.将潜在的序列和相应的基因组数据库〔人,或者小鼠,大鼠等等〕进行比拟, 排除那些和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST〔 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 〕o 7 .选出适宜的目标序列进行合成.通常一个 基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列.8 .阴性对照: 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中 的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性.通常的做法是 将选中的siRNA序列打乱,同样需要检查它和其他基因是否具有同源性.9 .有 结果显示,UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别,由于这个突出 端无需和靶序列互补.合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列.siRNA转染的方法哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、 DEAE葡聚糖和polybrene.机械法〔例如,显微注射和基因枪\阳离子脂质体 试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法〔具体转染方法可 参考 In\'itrogen Lipofectaniine 2000,.贴壁细胞转染程序以24孔板为例,假设要检测基因沉默或者过表达效果,推 荐最低RNA oligo终浓度为50nM 〔不同细胞可以上下优化2-4倍浓度〕;遵循以 下操作方法可以高效地将RNA oligo转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞.但是 对某些特殊的细胞系和培养条件,或特殊应用等,也需要单独特别优化.1 .细胞 铺板转染时细胞密度:一般来说,当细胞密度到达60・80%时进行转染可以取得 较高的转染效率.然而,不同细胞的最适转染空度都不尽相同.因此在初次转染 某种细胞时,可以通过预实验先确认该细胞最正确的状态及转染密度.2.复合物的 制备及转染1〕使用前将GP・transfect・Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混 匀;2〕在1.5 nil无菌离心管中参加50 口无血清培养基或OPTI-MEM ,并添加适 量的转染试剂,用移液器轻轻混匀,室温静置5 min ; 3〕同时在另一1.5 ml无菌 离心管中参加50可无血清培养基或OPTLMEM,并添加适量的RNAoligo/DNA 〔参见表2〕,用移液器轻轻混匀,室温静置5 min.4〕将GP・tl•ansfect・Mate・培养基 混合物滴加至RNA oligo/DNA.培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置 15-20 min后,立即转染.注:复合物尽量在60 niin内使用,并且GP-tiansfect- Mate.培养基混合物和RNAoligo/DNA・培养基混合物的混合次序非常重要,切勿 颠倒.3.转染过程1〕趁静置时,给24孔板换液,每孔换上400 m预热的新鲜培 养基;2〕将100卜11转染混合物参加孔中,终体系为500可.加完后将板轻轻晃动 以使复合物均匀分布;3〕37℃静置培养细胞,4 -6h换成完全培养基.2 4-72 h检 测mRNA表达,4 8-96 h检测蛋白表达.13操作流程〔24孔板〕以24孔板为例,假设要检测基因沉默的效果,推荐 最低siRNA终浓度1011M :假设要在显微镜下从荧光强度看转染效率,因荧光信 号被检测到需要一定的敏感度,推荐siRNA终浓度50iiMo遵循以下操作方法 可以高效地将siRNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞.A.细胞铺板贴壁细胞数量:在转染实验之前的18・24个小时,在每个孔的 500m生长培养基中参加1.535x104个细胞〔保证转染时细胞密度在30-50% \ 悬浮细胞数量:转染实验的当天,在500卜d生长培养基中参加1-2x105个细胞. 注意:转染时应保证细胞没有过度生长或处于休止期.B.转染复合物的制备1.将 siRNA-Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混匀;2.将100可OPTI-MEM 或无血清培养基参加无菌EP管中;3.在上述含有无血清培养基的EP管中参加 lOpmol (140ng)待转染的siRNA ,并充分混匀.随后在管子中参加2可siRNA・ Mate转染试剂,快速涡旋10s使其完全混匀;4.室温静置10分钟,使siRNA 和转染试剂形成转染复合物.静置时间不要超过30min°C.转染过程1.趁静置时, 给24孔板换液,每孑眼上0.5ml预热的新鲜培养基;2.将静置完毕的100Pl转 染复合物参加孔中,终体系为600M , siRNA终浓度为16.7iiMo加完后将细胞 培养板轻晃摇匀.3.37.(3静置培养细胞,检测基因沉默水平可在24-72h内收样 检测mRNA ( RT-PCR实验等)或48-9611内检测蛋白(Western Blot实验等工常见问题L针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效?一般siRNA都具有物种特异性,很少与其他物种有相同的靶位点,所以针对人 体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列.然而,也有研究说明siRNA 经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效,这需要仔细进行siRNA设 计和生物信息学分析.2 .你们提供的siRNA是怎样装运的?如果在常温下放置了一个星期,还有效吗? siRNA是冻干粉包装的,在常温下运输.这些冻干的样品在室温下能稳定保存2-4个星期,所以放置一个星期不会影响其沉默效果.但我们建议您收 到样品后最好保存于-2(rc或-7(TC有霜冷冻箱中.3 .在体外实验中,需要多少量的siRNA ?我们建议您用于实验的siRNA的浓度为lOOnM.1 nmol siRNA的量对于 一个24孔板或是96孑版的实验已经足够了.4 .用100nM的siRNA转染时只得到50%沉默效率,我可以将siRNA 的浓度增加到200nM甚至400nM吗?增加siRNA的浓度一般不能改良沉默效率.高浓度的siRNA将可能导致 去靶作用和对细胞的毒性.siRNA的高基因沉默效率来自于合理的设计,在 100nM甚至更低的浓度都可能有75%的沉默效率.另外,低的转染效率会导致 低的沉默效率,建议您更进一步优化siRNA的导入条件.5.24定量RNA的公式是什么?研究者可以用Beer法那么定量RNA :吸光度(260nm)=(摩尔消光系数)*(浓 度)*(路径氏度,cm).为了便于理解,等式变为:浓度二(吸光度,260nm)/[(摩尔 消光系数)*(路径氏度,cm)].当使用一个标准的10mm比色皿时,在公式中路 径氏度这个变量等于1.6m浓度为10uM的siRNA溶解液中含有多少卜唱的 siRNA ?首先计算含有多少 nmol 的 siRNA : a.等式:?nmol=(6|il)(10uniol/L) ; b. 单位换算:?nmol= (6|il)( 10|imol/L)( 1 L/l ,000,000pl)(1,000nmol/jimol) ; c.答 案:?nmol=0.06nmol.然后利用 siRNA 的平均分子量 13,300g/mol)*nmol 变为 pg : a. 等 式: ? Hg=(0.06miiol)( 13,3 OOg/mol) ; b. 单 位 换 算:?Ng=(0.06nmol)(13,300g/mol)(lmol/L000,000,00 Omnol)(l,OOO,OOO|.ig/g) ; c.答 案:?卜唱=0.798约0.8卜唱.所以6m浓度为10gM的siRNA溶解液中含有0.8卜唱的 siRNA.我需要浓度为20uM的样品,如何计算重悬siRNA缓冲液的量?样品 浓度的计算如下:(siRNA的量,nmol)/(重悬体积,卜il)=样品浓度…mol/L.在 解答前应先统一单位,保证单位可以抵消.例如:您购置了 20nmol的siRNA , 想溶解为5 OpM的样品.可按以下方法计算重悬缓冲液体积:a.等式:(20 mnol)/?|il=50umol/L ; b.解答未知量:?卜il=(20nmol)(lL/50umol) ; c.单位换 算:?m=(20nmol)(lL/50 卜 imol)(lNmol/l,000nniol)(l,000,000Nl/lL) ; d.答 案:?j.d=400j.do因此,应该使用400|.d缓冲液去重悬20nmol的siRNA ,溶解后 为50pM的样品.一定需要阴性对照吗?是,阴性对照是RNA干扰实验中不可缺少的.由于在超过200nM的浓 度下,siRNA有可能会导致非特异性的压力反响,在实验体系中必需设置阴忸寸 照.它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结 果.由于siRNA的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉 默现象.如果没有阴性对照,研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉 默当作由RNAi引起的基因特异性沉默.常用的阴性对照有哪些类型?常用的阴性对照大体分为两种,一种是使用通用阴性对照序列,该序列已 经被上千篇文章使用;另一类是使用和靶基因siRNA打乱序列的siRNA作为 阴性对照,这样的阴性对照和通用序列相比拟,一方面合成是根据定制产品价格 合成的,另一方面,由于打乱序列是没有经过验证的序列,有可能会产生.ff target 现象.因此,除非有非常特殊的要求,最好使用通用序列作为阴性对照.在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果,这是什么原因? 这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性.该结果说明您所观察到的表型不是 序列特异性knockdown产生的表型,您需要降低siRNA的工作浓度.为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的.也就是说,当您看到。












