萌发小麦种子淀粉酶酶学性质研究.doc

萌发小麦种子淀粉酶酶学性质研究陈晓蒙（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨，150030）摘要：本研究以萌发的小麦种子为材料，提取得到淀粉酶液利用分光光度计法测定淀粉酶分解淀粉所得还原糖与 3,5-二硝基水杨酸的还原产物的吸光值，从而得出酶活标准曲线根据 α-淀粉酶和 β-淀粉酶对温度的差异，采用加热的方法钝化 β-淀粉酶，测定出 α-淀粉酶的活性在非钝化条件下测定淀粉酶的总活力将小麦分为种子、芽和整个小麦分别来测定研究影响淀粉酶活性的因素，在不同温度、不同 pH 值、激活剂和抑制剂的条件下由酶反应混合物遇碘呈现的颜色判断出酶活性的的最适温度为 40℃，最适 pH 值为 5.6，NaCl 为激活剂，CuSO4 为抑制剂通过研究淀粉酶的性质使我们更充分地了解，并利用于工业生产、食品加工、医疗等产业关键词：淀粉酶 活力 温度 PH 激活剂和抑制剂The enzymatic properties of amylase in Wheat Seed GerminationXiaomeng ChenNortheast Agricultural University Biological Sciences1301 Zip .Code:150030引言：酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成，只有在适当的温度 pH和离子强度下才具有生物活性。

而且生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的，酶既能催化各种生化反应，还能调节和控制代谢的速度、方向和途径，是新陈代谢的调节元件淀粉酶广泛分布在植物和动物体内，特别是萌发谷物种子它具有水解淀粉的能力，对生物有很大的影响作用而淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料因此研究淀粉酶有重要的意义现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括药学、食品、化学工业、诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需要生产规模和产业均很乐观，并已产生巨大经济效益1材料与方法 1.1材料 萌发的小麦种子（芽长约 1cm）1.2 方法 1.2.1 麦芽糖标准曲线的制作取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，1-7 号试管加入麦芽糖标准溶液分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml，再分别加入蒸馏水2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2、0ml，使得 1-7 号试管中麦芽糖含量分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 和 2.0mg再分别加入 10g·L-13,5-二硝基水杨酸2.0ml，将各试管置于沸水浴中加热 5min，取出后冷却至室温，用蒸馏水定容至 20ml。

用 1 号试管做对照组，空白调零，在 520nm 下，分别测定 2-7 号试管的吸光值 A以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线1.3.1淀粉酶活力的制备与测定称取 1g 萌发的小麦种子不同部位，置于研钵中，加少量石英砂和 2ml 蒸馏水，研磨匀浆，用 6ml 蒸馏水粉刺将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取 15—20min , 每隔数分钟搅拌一次，使其充分提取然后在 4000 r/min 转速下离心 10min ，将上清液倒入 250ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于淀粉酶活性的测定吸取上述酶原液 1ml，放入 25ml 容量瓶中，定容摇匀，即得到淀粉稀释液1.3.2α-淀粉酶活力的测定：取 3 支干净试管，编号，1 号加入 1.0ml 淀粉酶原液，置于 70 摄氏度水浴15min，冷却，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入 PH5.6 的缓冲溶液 1.0ml，0.4MNaOH 溶液 4.0ml，1％淀粉溶液 2.0ml，在40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 0.0ml；2号加入 1.0ml 淀粉酶原液，置于 70 摄氏度水浴 15min，冷却，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入 PH5.6 的缓冲溶液1.0ml，0.4MNaOH 溶液 0.0ml，1％淀粉溶液 2.0ml，在 40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 4.0ml；3 号加入 1.0ml 淀粉酶原液，置于 70 摄氏度水浴 15min，冷却，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入 PH5.6 的缓冲溶液 1.0ml，0.4MNaOH 溶液0.0ml，1％淀粉溶液 2.0ml，在 40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 4.0ml。

1.3.3 总酶活力的测定：取 3 支干净试管，编号，1 号加入 1.0ml 酶稀释液，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入 PH5.6 的缓冲溶液1.0ml，0.4MNaOH 溶液 4.0ml，1％淀粉溶液 2.0ml，在 40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 0.0ml；2 号加入 1.0ml 酶稀释液，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入 PH5.6 的缓冲溶液 1.0ml，0.4MNaOH 溶液 0.0ml，1％淀粉溶液 2.0ml，在 40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 4.0ml；2 号加入 1.0ml酶稀释液，将各个试管和淀粉溶液置于 40 摄氏度恒温水浴中保温 10min，加入PH5.6 的缓冲溶液 1.0ml， 0.4MNaOH 溶液 0.0ml， 1％淀粉溶液 2.0ml，在 40 摄氏度恒温水浴中准确保温 5min，保温过后加入 0.4MNaOH 溶液 4.0ml将各试管摇匀，分别取 2ml 放入 25ml 刻度管中，再加入 2mlDNS 试剂混匀沸水浴 煮沸 5min 取出冷却，再用蒸馏水稀释至 25ml 混匀，在分光光度计上 540nm 处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。

1.4.1淀粉酶粗酶液的提取称取 0.5 克萌发小麦种子，研磨后放置 5min，在 4000r/min 的条件下离心，10min 后取上清液于 25ml 容量瓶并定容至刻度线1.4.2 温度对淀粉酶活性的影响取 6 支试管，分别标记 A，a，B，b，C，c，D，d，A 号管中加入 PH5.6的缓冲液 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，保温于 4 摄氏度环境中，将 a 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液，然后将 A 中混合液倒入 a 中，在 4 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，取出，冷却至室温，加入碘液 1-2 滴，观察其颜色；B 号管中加入 PH5.6 的缓冲液 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，保温于室温环境中，将 b 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液，然后将 B 中混合液倒入 b 中，在室温条件下进行酶促反应 10min，取出，冷却至室温，加入碘液 1-2 滴，观察其颜色C 号管中加入PH5.6 的缓冲液 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，保温于 40 摄氏度环境中，将 c 管中加入 1.0ml 淀粉酶提取液，然后将 C 中混合液倒入 c 中，在 40 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，取出，冷却至室温，加入碘液 1-2 滴，观察其颜色；D 号管中加入 PH5.6 的缓冲液 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，保温于沸水浴环境中，将 d 管中加入 1.0ml 淀粉酶提取液，然后将 D 中混合液倒入 d 中，在沸水浴条件下进行酶促反应 10min，取出，冷却至室温，加入碘液 1-2 滴，观察其颜色。

1.4.3 pH 对淀粉酶活性的影响取三支试管，编号，1 号试管中加入 PH=3.0 的 Buffer 溶液 2.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液 1.0ml，混匀，在 40 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，加1 滴碘液，观察颜色反应2 号试管中加入 PH=5.6 的 Buffer 溶液 2.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液 1.0ml，混匀，在 40 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，加 1 滴碘液，观察颜色反应3 号试管中加入 PH=8.0 的 Buffer 溶液 2.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液 1.0ml，混匀，在 40 摄氏度条件下进行酶促反应10min，加 1 滴碘液，观察颜色反应1.4.4 激活剂或抑制剂对淀粉酶活性的影响取三支试管，编号，1 号管中加入 PH5.6 的 Buffer 溶液 2.0，NaCl 溶液1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液 1.0ml，混匀，于 40 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，取出，加入碘液 1 滴观察其颜色；2 号管中加入 PH5.6 的 Buffer溶液 2.0，CuSO4 溶液 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液 1.0ml，混匀，于 40摄氏度条件下进行酶促反应 10min，取出，加入碘液 1 滴观察其颜色；3 号管中加入 PH5.6 的 Buffer 溶液 2.0，蒸馏水 1.0ml，淀粉溶液 2.5ml，酶提取液1.0ml，混匀，于 40 摄氏度条件下进行酶促反应 10min，取出，加入碘液 1 滴观察其颜色。

2.结果与分析2.1 淀粉酶活性由计算得α—淀粉酶 总淀粉酶部位芽 种子 整体 芽 种子 整体活性数（麦芽糖 mg/g 鲜重·5min）19.94 13.17 5.34 498.39 353.36 280.852.2 温度对淀粉酶活性的影响1 号管：4℃，淀粉几乎未被水解，酶几乎完全失活；2 号管：室温，淀粉被部分水解，酶的活性受到一定的抑制；3 号管：40℃，淀粉几乎完全被水解，酶的活性达到相对最大；4 号管：100℃，淀粉未被水解，酶完全失活由图可知，40℃是小麦淀粉酶最适温度淀粉酶的最适温度是 40℃，温度偏高偏低都会影响酶的活性甚至导致酶的失活致使在一定时间内淀粉的水解，如果淀粉失活这淀粉不水解（例如本实验的 100℃的试管）在一定温度范围内，淀粉酶的活性随温度的升高而增强，当达到某一温度（40℃左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一温度后，酶的活性随温度的升高而减弱2.3 pH 对淀粉酶活性的影响1 号管：pH=3.0 淀粉几乎未被水解，酶几乎完全失活；2 号管：pH=5.6 淀粉几乎完全被水解，酶的活性相对达到最大；3 号管：pH=8.0 淀粉部分被水解，酶的活性受到一定的抑制作用。

由图可知，pH=5.6 是淀粉酶的最适 pH 值PH 值是影响酶活的主要因素，通常各种酶只在一定的 PH 范围内才表现出活性，同一种酶在不同的 PH 下所表现的活性不同，其活性最高时的 PH 称为酶的最适 PH 值 PH 影响酶分子构象的稳定性,影响酶分子极性基团的解离状态,也影响底物的解离2.4 激活剂或抑制剂对淀粉酶活性的影响1 号管：加 NaCl 溶液，淀粉相对水解完全，酶的活性增加；2 号管：加 CuSO4 溶液，淀粉部分被水解，酶的活性受到一定的抑制作用；3 号管：加蒸馏水，对照组NaCL 中 CL 离子为淀粉酶激活剂，CL 离子使淀粉酶活性增强； CuSO4 中Cu 离子为淀粉酶抑制剂，Cu 离子使淀粉酶活性减弱2.讨论与结论影响淀粉酶活性的因素是多方面的本实验着重研究了温度、pH 、激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响在实验过程中，温度、pH 值、激活剂和抑制剂是影响酶活性的几个重要因素，只研究其中一个因素对酶活性的影响时，要尽量控制其他因素在最适标准上，从而研究这一单一因素对酶活性的影响由实验结果可知，在一定温度范围内，低温时酶对淀粉的反应影响较慢，到达最适温度（40℃左右）是反应速率最快，此后随温度升高，酶的活性对反应的影响减慢，高温。