
DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享).ppt
21页作者:Dr.FengDNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应,但主要为分子筛效应 在 pH 值为 8.08.3 时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的 核酸分子中嵌入荧光染料(如 EB )后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)实验器材和试剂 实验器材: 桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪 样品: DNA分子量标准品,质粒 试剂 琼脂糖 1电泳缓冲液(TBE) 6上样缓冲液 溴化乙锭(EB) :10mg/mlDNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)上样缓冲液0.25溴酚兰;0.25二甲苯青;30甘油水溶液 作用: 增加样品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色,使加样操作更方便DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 天然琼脂(agar):又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
琼脂糖(agarose)琼脂胶(agaropectin):含硫酸根和羧基的强酸性多糖,在电场作用下能产生较强的电渗现象琼脂DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法 该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)电泳指示剂: 核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝( bromophenol blue, Bb ); 二甲苯青( xylene cyanol, Xc ),它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭(ethidium bromide,EB) 是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出桔红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min EB染料有许多优点,如染色操作简便、快速,灵敏度高,10ng或更少的DNA即可检出。
注意:EB被认为是一种强致癌物质,操作时应尽量小心,配置和使用EB时都应带上手套,且注意不要把EB洒到桌面或地板上 ) 银染色DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小:实验证明,DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比; 琼脂糖的浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中,电泳迁移率不相同;DNA分子的构型:不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)琼脂糖凝胶的优点琼脂糖凝胶的优点(1) 操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可进行电泳2)琼脂糖凝胶结构均匀,对样品吸附极微,因此电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好3)琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析4)电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定量测定制成干膜可长期保存DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)缺点:缺点:1.1.机械强度差机械强度差,易破碎,浓度不能太低易破碎,浓度不能太低2.2.易被细菌污染易被细菌污染,不易保存,临用前配制不易保存,临用前配制3.3.琼脂糖支持层上的琼脂糖支持层上的区带易于扩散区带易于扩散,电泳后必须立即固定染色。
电泳后必须立即固定染色4.4.与与PAGEPAGE相比,相比,分子筛作用小分子筛作用小,区带少DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享) 银染色 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染成黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色,也用于琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍,但银染色后,DNA不宜回收DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)实验操作 制备琼脂凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外透射仪检测DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)操作步骤1. 准备用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净,放在水平桌面上,并架好梳子DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤: 三角瓶内:0.6g琼脂糖 +60ml(0.5TBE) 煮胶溶解 冷却至60(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面12nmDNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)3. 加样 将DNA样品(5ul)与6 上样缓冲液(1ul) 混匀后,用微量加样枪小心加入样品孔内。
注意加样枪的枪头不可插入过深,以免刺穿凝胶,导致样品外溢 每加完一个样品要更换枪头,以防止EB污染 DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)4. 电泳 接通电源,一般红色为正极,黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负),电压为5 V/cm(长度以两个电极之间的距离计算) 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处,停止电泳DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)5. 结果观察 电泳结束后,将凝胶板取出在紫外仪上观察电泳带及其位置,记录实验结果DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)感谢您的阅览(此课件下载后可以自行编辑修改 关注我 每天分享干货)DNA琼脂糖凝胶电泳分析(精品课件)(课件分享)。
