第十一章分子生物学课件（PCR技术）.ppt

PCRPCR技术及其应用技术及其应用第十一章第十一章PCR技术原理技术原理第一节第一节一、一、PCR技术原理技术原理v是一种在体外由引物介导的特定是一种在体外由引物介导的特定DNA序列扩序列扩增的酶促反应通过重复进行的增的酶促反应通过重复进行的DNA复制过复制过程，获得呈指数增长的程，获得呈指数增长的DNA拷贝数v每一次每一次DNA的扩增包括的扩增包括3个步骤，即一个循个步骤，即一个循环：环：                        变性变性—退火退火—延伸延伸               DNA形成单链模板形成单链模板—引物与模板结合引物与模板结合—DAN聚合酶合成子代聚合酶合成子代DNA PCR的基本条件的基本条件vv在微量离心管中进行在微量离心管中进行在微量离心管中进行在微量离心管中进行vv适量的缓冲液适量的缓冲液适量的缓冲液适量的缓冲液vv微量的模板微量的模板微量的模板微量的模板DNADNAvv四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸vv耐热性耐热性耐热性耐热性DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶vv一对合成一对合成一对合成一对合成DNADNA引物引物引物引物PCR的特点的特点高度的灵敏性高度的灵敏性30轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍从从pg (10pg (10-12-12) )可扩增至可扩增至 mg (10mg (10-6-6) )水平水平 特异性特异性引物引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是引物的序列及其与模板结合的特异性是决定决定PCRPCR反应结果的关键。

反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度地提高引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增异性扩增简便、快速简便、快速 2 2～4 4 小时完成扩增反应小时完成扩增反应总体积总体积               50-100  l              Buffer                缓冲液缓冲液              dNTP                 原料原料              Primer               引物引物              DNA分子分子            模板模板               Taq酶酶                 DNA聚合酶聚合酶二、二、PCR反应体系反应体系单、双链单、双链单、双链单、双链DNADNA均可均可均可均可不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑聚合酶抑聚合酶抑聚合酶抑      制剂、制剂、制剂、制剂、DNADNA结合蛋白类结合蛋白类结合蛋白类结合蛋白类模板浓度一般为模板浓度一般为模板浓度一般为模板浓度一般为100ng DNA100ng DNA模板模板模板模板/100/100   L L。

         过高会导致反应的非特异性增加过高会导致反应的非特异性增加过高会导致反应的非特异性增加过高会导致反应的非特异性增加DNA 模板模板vv引物浓度一般为引物浓度一般为0.1-0.5 μmol/L vv浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降反应特异性下降引引   物物（（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区, ,与非扩增区无同源序与非扩增区无同源序列2 2）引物长度以）引物长度以15-4015-40（（1818～～2525个）个）bpbp为宜3 3））碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占45-55%45-55%4 4）引物内部避免形成二级结构引物内部避免形成二级结构5 5）两引物间避免有互补序列两引物间避免有互补序列6 6）引物）引物3 3 ′端端为为关键碱基关键碱基；；5 5 ′端无严格限制端无严格限制，可，可被修饰被修饰引物设计原则引物设计原则vv从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（80℃℃～～90℃℃）中的）中的水栖噬热菌（水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq））中提取，有很高的耐热稳定性中提取，有很高的耐热稳定性 vv浓度为浓度为0.5-2.5 U/50  lvv酶量增加使反应特异性下降；酶量过少酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。

影响反应产量Taq DNA聚合酶聚合酶vvTaq DNA聚合酶无聚合酶无3´→ 5´外切酶活性，因外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配生碱基错配 vvTaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为突变率为1/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/8000，因此扩增的片段越长，错配的机率越高，因此扩增的片段越长，错配的机率越高 Taq DNA聚合酶聚合酶其他耐热其他耐热DNA聚合酶聚合酶v耐热的高保真耐热的高保真 DNADNA聚合酶：聚合酶： Pwo DNA polymerase Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Tth DNA polymerase Pfu DNA polymerase Pfu DNA polymerasev高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率vvdNTP浓度取决于扩增片段的长度（浓度取决于扩增片段的长度（ 20～～200μmol/L ））vv四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等vv浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低浓度过低则降低反应产量则降低反应产量vvdNTP可与可与Mg2+结合结合,使游离的使游离的Mg2+浓度浓度下降下降,影响影响DNA聚合酶的活性。

聚合酶的活性dNTPvvMg2+是是DNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂vv使用浓度为使用浓度为dNTP浓度为浓度为200μmol/L时，时，MgCl2浓度为浓度为1.5mmol/L较宜较宜））vvMg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降； Mg2+过高影响反应特异性过高影响反应特异性vvMg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTP、、EDTA、引物、模板等可降低游离、引物、模板等可降低游离的的Mg2+浓度，影响酶的活性浓度，影响酶的活性 Mg2+vvpH：：反应所需的最适反应所需的最适pH值在值在左右左右 vv盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交利于引物与模板杂交 vv基质：牛血清白蛋白、明胶、基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20、、DTT等等  其他反应因素其他反应因素vv变性变性变性变性                   使双链使双链使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链解链为单链解链为单链94 94 ℃℃℃℃   ；；；；3030秒秒秒秒vv退火退火退火退火                     温度由引物长度和温度由引物长度和温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。

含量决定含量决定含量决定TmTm－－－－5 5 ℃℃℃℃；；；；3030秒秒秒秒                  TmTm估算公式：估算公式：估算公式：估算公式：Tm=4× Tm=4× （（（（G+CG+C））））   +2 × +2 × （（（（A+TA+T））））                增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；                降低温度可增加反应的灵敏性降低温度可增加反应的灵敏性降低温度可增加反应的灵敏性降低温度可增加反应的灵敏性vv延伸延伸延伸延伸                延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定7272℃℃℃℃；；；；3030秒秒秒秒~1~1分钟分钟分钟分钟vv循环次数循环次数循环次数循环次数              主要取决于模版主要取决于模版主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度一般为的浓度一般为的浓度一般为的浓度一般为25-3525-35次次次次              次数过多：扩增效率降低（平台效应），错误掺入率增加次数过多：扩增效率降低（平台效应），错误掺入率增加次数过多：扩增效率降低（平台效应），错误掺入率增加次数过多：扩增效率降低（平台效应），错误掺入率增加三、三、PCR反应条件反应条件      ————循环参数设置循环参数设置平台效应出现的影响因素平台效应出现的影响因素v模板初始量越多，平台出现越早；模板初始量越多，平台出现越早；v引物二聚体形成；引物二聚体形成；v反应产物（反应产物（PPi、扩增产物与引物对模板、扩增产物与引物对模板的竞争）的反馈性抑制；的竞争）的反馈性抑制；v反应体系中各组份的消耗；反应体系中各组份的消耗；v酶活性的降低等。

酶活性的降低等四、四、PCR自动化自动化              ——DNA——DNA扩增仪扩增仪vRCR仪分为三大类，主要通过仪分为三大类，主要通过变温铝块变温铝块、、变变温水浴温水浴及及变温气流变温气流的方式达到热循环的目的的方式达到热循环的目的v各种仪器一般都配有各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、微电脑自动控制温度、时间及循环数时间及循环数五、五、PCR产物的检测产物的检测v凝胶电泳检测vHLPCv固相测定系统vSPA(Scintillation Proximity Assay)系统 v点杂交检测系统v电化学发光检测系统  vDNA酶免疫测定系统  v激光诱导荧光检测法  六、六、PCR质量控制质量控制实验室设置不当和实验人员操作不规范实验室设置不当和实验人员操作不规范是导致结果不准确的主要原因是导致结果不准确的主要原因v实验室的规范设置实验室的规范设置v影响质量的因素影响质量的因素:假阳性、假阴性假阳性、假阴性临床基因扩增实验室设置临床基因扩增实验室设置v包括包括4个区域：个区域：试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区；；标本制备标本制备区区；；扩增反应区扩增反应区；；产物分析区产物分析区。

v区域设置的原则：因地制宜、相互独立、单区域设置的原则：因地制宜、相互独立、单向循环、仪器专用、器材不能换区使用向循环、仪器专用、器材不能换区使用v可在可在PCR实验区之外进行标本的前处理，如实验区之外进行标本的前处理，如分离血清等分离血清等假阳性及防治假阳性及防治v污染是导致污染是导致PCR假阳性的主要原因污假阳性的主要原因污染主要来自于：扩增产物的污染（为最染主要来自于：扩增产物的污染（为最主要的来源）、试剂及器材污染、标本主要的来源）、试剂及器材污染、标本间的交叉污染、实验人员的污染等间的交叉污染、实验人员的污染等v污染的防治：控制污染的方法主要有两污染的防治：控制污染的方法主要有两种种—— ①①规范化的实验操作、良好的实规范化的实验操作、良好的实验环境；验环境；②②使用尿嘧啶使用尿嘧啶DNA糖基化酶糖基化酶（（UDG酶，或称为尿嘧啶酶，或称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶糖基化酶或或UNG酶）防止污染的具体方法防止污染的具体方法v实验室要求实验室要求：为：为 PCR 样品配制和扩增后分析设计隔离的区样品配制和扩增后分析设计隔离的区域；域；v操作要求操作要求：使用抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入：使用抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入 eppendorf 管内；在准备新反应前更换手套；试验用器材管内；在准备新反应前更换手套；试验用器材高压消毒或高压消毒或10％次氯酸钠消毒、清洁实验台面、％次氯酸钠消毒、清洁实验台面、254254nmnm波长波长紫外线照射；减少开盖次数紫外线照射；减少开盖次数v设置对照设置对照：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的：阴性对照、阳性对照、内对照；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。

反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入vUNG防污染防污染：在：在 PCR 反应液配制时，将反应液配制时，将dUTP和和dTTP 按一按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对 UNG 敏感，在敏感，在 PCR 前对新配制的反应用前对新配制的反应用 UNG 处理以破坏处理以破坏残余产物，杜绝污染残余产物，杜绝污染假阴性及防治假阴性及防治v假阴性的原因：假阴性的原因：DNA损失；试剂失效；损失；试剂失效；DNA突变；存在酶抑制剂；标本中突变；存在酶抑制剂；标本中DNA未未充分释放；充分释放；…v防止假阴性的措施：防止抑制酶活性的因防止假阴性的措施：防止抑制酶活性的因素存在；充分处理标本暴露素存在；充分处理标本暴露DNA ；；…PCR的类型的类型第二节第二节 目的目的：扩增产生特异长度的单链：扩增产生特异长度的单链DNADNA 方法方法：采用两种不同浓度的引物分别称为限：采用两种不同浓度的引物分别称为限制性引物和非限制性引物制性引物和非限制性引物, ,其最佳比例一般是其最佳比例一般是μμm m, ,关键是限制性引物的绝对量。

关键是限制性引物的绝对量 用途用途：制备核酸序列测定的模板：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究不对称PCR反向反向PCR (reverse PCR)vv目的目的：对某个已知：对某个已知DNA片段两侧的未知序列片段两侧的未知序列进行扩增进行扩增vv方法方法：用反向互补引物扩增两引物以外的：用反向互补引物扩增两引物以外的DNA片段片段vv用途用途：探索邻接已知：探索邻接已知DNA片段的序列；用于片段的序列；用于仅知部分序列的全长仅知部分序列的全长cDNA的克隆的克隆,扩增基因扩增基因文库的插入文库的插入DNA；建立基因组步移文库建立基因组步移文库已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列多重多重PCR (multiplex PCR) 目的和方法目的和方法：在同一：在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的同时扩增出多个核酸片段的PCR反应用途用途：主要用于多种病原微生物的同时检测；病原微生物、：主要用于多种病原微生物的同时检测；病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型；突变或缺失存在多个好发部位某些遗传病及癌基因的分型；突变或缺失存在多个好发部位的检测。

的检测注意注意：引物之间的干扰以及产物片段长度的重叠影响结果：引物之间的干扰以及产物片段长度的重叠影响结果的准确性；每对引物应当有相近的的准确性；每对引物应当有相近的Tm值、值、GC%含量和长度；含量和长度；产物大小能够保证相差大于产物大小能够保证相差大于150bp引物引物ⅠⅠ1引物引物ⅠⅠ2引物引物ⅡⅡ1引物引物ⅡⅡ2引物引物ⅢⅢ1引物引物ⅢⅢ2逆转录逆转录PCR （（RT-PCR））(reverse transcription PCR) 概念概念：利用逆转录酶将细胞：利用逆转录酶将细胞mRNA逆转录为逆转录为cDNA，再以此为模板通过，再以此为模板通过PCR进行进行DNA扩增扩增 用途用途：主要用于克隆：主要用于克隆 cDNA、、合成合成cDNA探针，探针，检测检测RNA病毒、分析基因表达等病毒、分析基因表达等实时荧光定量实时荧光定量PCR第三节第三节实时荧光定量实时荧光定量 PCR（（real-time PCR)方法方法方法方法：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针, ,对对对对PCRPCR产物进行标记跟踪，实时监控扩增反应中产物进行标记跟踪，实时监控扩增反应中产物进行标记跟踪，实时监控扩增反应中产物进行标记跟踪，实时监控扩增反应中每一个循环产物荧光信号，结合相应的软件对结果每一个循环产物荧光信号，结合相应的软件对结果每一个循环产物荧光信号，结合相应的软件对结果每一个循环产物荧光信号，结合相应的软件对结果进行分析，从而实现对起始模板定量及定性分析。

进行分析，从而实现对起始模板定量及定性分析进行分析，从而实现对起始模板定量及定性分析进行分析，从而实现对起始模板定量及定性分析用途用途用途用途：基因拷贝数的检测（病原微生物含量；转基：基因拷贝数的检测（病原微生物含量；转基：基因拷贝数的检测（病原微生物含量；转基：基因拷贝数的检测（病原微生物含量；转基因动植物转基因拷贝数量；因动植物转基因拷贝数量；因动植物转基因拷贝数量；因动植物转基因拷贝数量；RNAi RNAi 基因失活率）；基因失活率）；基因失活率）；基因失活率）；                                  基因表达差异分析；基因表达差异分析；基因表达差异分析；基因表达差异分析；                      基因分型（基因分型（基因分型（基因分型（   SNP SNP 检测，甲基化检测）检测，甲基化检测）检测，甲基化检测）检测，甲基化检测）   在实时荧光定量在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化反应中，引入了一种荧光化学物质，随着学物质，随着 PCR 反应的进行，反应的进行， PCR 反应产物不反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个断累计，荧光信号强度也等比例增加每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线荧光扩增曲线                                            实时荧光实时荧光扩增曲线图扩增曲线图荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩荧光信号指数扩增阶段和平台期在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信增阶段和平台期在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化而在平台期，扩增产物已不再呈指号所掩盖，无法判断产物量的变化而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数只有在荧光信拷贝数只有在荧光信号指数扩增阶段，号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存性关产物量的对数值与起始模板量之间存性关系，因此应选择这个阶段进行定量分析。

系，因此应选择这个阶段进行定量分析 一、实时荧光定量一、实时荧光定量PCR原理原理定量定量PCR的数学原理的数学原理y=x(1+e)ny：产物分子数：产物分子数     x：起始分子数：起始分子数e：扩增效率：扩增效率         n：循环次数：循环次数    与普通与普通PCR的区别（一）的区别（一）v普通普通PCR技术：技术：    在在PCR结束后对结束后对终点产物终点产物进行定量分析进行定量分析v实时定量实时定量PCR技术：技术：实时检测实时检测PCR扩增，在扩增的扩增，在扩增的指数期指数期对对起始模板进行定量起始模板进行定量起始定量与终点定量起始定量与终点定量起始起始DNA量是量是“天然天然”的量，更有意义；终的量，更有意义；终点点DNA量是经过量是经过PCR“加工加工”，存在部分失真，存在部分失真起点定量重现性好；终点定量误差大起点定量重现性好；终点定量误差大由于由于PCRPCR扩增效率的差异使得相同扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异的样品扩增结果存在很大的差异相同模板进行相同模板进行9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图实时监控实时监控实时监控实时监控      能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加能够实时地观察到产物的增加, ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性     使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合, ,提高了提高了提高了提高了PCRPCRPCRPCR反应反应反应反应的特异性的特异性的特异性的特异性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性      全程监控全程监控全程监控全程监控, ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量准确的算法进行定量准确的算法进行定量减少污染减少污染减少污染减少污染     采用闭管检测，不需采用闭管检测，不需采用闭管检测，不需采用闭管检测，不需PCRPCR后处理，并采用后处理，并采用后处理，并采用后处理，并采用dUTP-UNGdUTP-UNG酶的防污染系统，酶的防污染系统，酶的防污染系统，酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成，避免假阳性。

扩增和检测一次同时完成，避免假阳性扩增和检测一次同时完成，避免假阳性扩增和检测一次同时完成，避免假阳性结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便, ,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶     光谱分析仪直读结果，自动分析，光谱分析仪直读结果，自动分析，光谱分析仪直读结果，自动分析，光谱分析仪直读结果，自动分析，   增强了灵敏性和客观性增强了灵敏性和客观性增强了灵敏性和客观性增强了灵敏性和客观性与普通与普通PCR的区别（二）的区别（二）几个定义几个定义什么是荧光域值（什么是荧光域值（threshold））　　　　PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的个循环的荧光信号的标准差的10倍，倍，即：即：           threshold = 10 SDcycle 3-15 几个定义几个定义什么是什么是 Ct 值值    C代表代表Cycle，，t代表代表threshold　　Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

　的域值时所经历的循环数　几个定义几个定义C(t) value 在扩增产物到达阈值线时：在扩增产物到达阈值线时：          Xct=X0(1+Ex)Ct=M                          （（1））XctXct：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为M M方程式（方程式（1）两边同时取对数得：）两边同时取对数得：          ㏒㏒M= ㏒㏒X0(1+Ex)Ct                                      （（2））整理方程（整理方程（2）得：）得：         ㏒㏒X0=﹣﹣㏒㏒(1+Ex) * *Ct+㏒㏒M               （（3））最后结论最后结论：： ㏒㏒X0与与Ct呈线性关系，根据样品设置的呈线性关系，根据样品设置的Ct值就可计算出样品中所含的模板量值就可计算出样品中所含的模板量Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系       每个模板的每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存性关值与该模板的起始拷贝数的对数存性关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标值越小利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表纵坐标代表Ct值因此，只要获得未知样品的值因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数•内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I I•序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqman探针探针 双杂交探针双杂交探针 Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)•引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) Amplifluor (Intergen)二、荧光定量二、荧光定量PCR标记检测类型标记检测类型v优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单荧光标记，操作亦比较简单 v缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高系中的荧光本底较高 内掺式染料内掺式染料（（SYBR GreenSYBR Green I I）标记的优、缺点）标记的优、缺点三、荧光定量三、荧光定量 PCR仪仪      荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR仪是一种仪是一种仪是一种仪是一种带有激发光源和荧光信带有激发光源和荧光信带有激发光源和荧光信带有激发光源和荧光信号检测系统的号检测系统的号检测系统的号检测系统的PCRPCR仪，仪，仪，仪，通常配有电脑系统及相通常配有电脑系统及相通常配有电脑系统及相通常配有电脑系统及相应的分析软件。

应的分析软件应的分析软件应的分析软件PCR技术的应用技术的应用第四节第四节一、基因克隆一、基因克隆v目的基因的扩增目的基因的扩增v重组分子的筛选重组分子的筛选三、基因诊断三、基因诊断v病原体基因是否存在病原体基因是否存在v内源性基因插入或缺失突变内源性基因插入或缺失突变   v扩增内源性基因，结合其他技术进行基因扩增内源性基因，结合其他技术进行基因结构分析结构分析v基因表达差异分析基因表达差异分析 v基因定量分析基因定量分析四、荧光定量四、荧光定量PCR的临床应用的临床应用v用于疾病的早期诊断用于疾病的早期诊断     PCR的高特异性及高敏感性能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床的高特异性及高敏感性能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中进行诊症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中进行诊断如肿瘤等断如肿瘤等“渐变性渐变性”疾病是因多基因积累性突变造成，及时检测到疾病是因多基因积累性突变造成，及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要v用于疾病的鉴别诊断用于疾病的鉴别诊断     区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗。

区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗v用于药物疗效的评价用于药物疗效的评价     准确定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控准确定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控v用于治愈标准的确定用于治愈标准的确定     用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立治愈标准的确立。