放射线抵抗宫颈癌细胞株DNA损伤修复基因表达谱的研究.pdf

第三军医大学博士学位论文放射线抵抗宫颈癌细胞株DNA损伤修复基因表达谱的研究姓名：卿毅申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王东20090501第三军医大学博十学位论文放射线抵抗宫颈癌细胞株D N A 损伤修复基因表达谱的研究摘要宫颈癌是我国女性发病率较高的恶性肿瘤之一，每年新增宫颈癌病例1 3 0 0 0 0 余例、死亡5 0 0 0 0 余例，其发病率与死亡率分别占我国妇科肿瘤的第一位和第二位，对中晚期或术后复发的宫颈癌患者，放射治疗是主要的治疗方法1 9 9 8 年，我院全国首家应用体外照射联合中子后装治疗宫颈癌，肿瘤局部控制率和5 年存活率分别为8 5 ．2 ％和8 8 ．7 ％，取得了良好的疗效，但在治疗过程中，我们观察到部分宫颈癌患者存在放射抵抗的问题，而且在临床实践中也发现治疗过程中有耐放射性改变，因此，研究影响宫颈癌细胞放射敏感性的因素具有十分重要的意义D N A 损伤修复是影响放射敏感性的重要因素，因此深入研究D N A 修复基因的表达谱，有助于阐明宫颈癌抵抗放疗的分子机制，为寻找提高宫颈癌放疗敏感性的分子靶点提供实验基础但D N A 损伤修复机制十分复杂多样，小数量的基因不能阐述清楚，需要参与D N A 损伤修复过程基因组的大量信息，这样才能真正了解其分子机制。

而基因芯片技术是一个强有力的获得癌细胞中成千上万的基因表达的综合性信息的工具，通过该技术可为研究D N A 损伤修复基因致宫颈癌放疗抵抗的分子机制提供有效方法因此本研究首先检测了D N A 损伤修复基因A P E l 在宫颈癌中的表达情况，分析A P E l 与宫颈癌的临床病理因素及锎．2 5 2 中子放疗的预后的关系，初步探讨了D N A损伤修复基因A P E l 与宫颈癌放射抵抗的相关性然后通过诱导建立宫颈癌耐放射细胞株，采用基因芯片技术对宫颈癌放D N A 损伤修复信号通路基因表达谱进行研究，筛选出G A D D 4 5 Q 等差异表达基因，构建G A D D 4 5 Q 表达载体并初步证明其增加宫颈癌放疗敏感性的作用研究目的1 ．探讨D N A 损伤修复基因A P E l 与宫颈癌放射抵抗的相关性；2 ．探讨D N A 损伤修复相关基因致宫颈癌放射抵抗的机制；3 ．初步探讨G A D D 4 5 a 表达载体增强宫颈癌放疗敏感性的作用研究内容和方法1 ．D N A 损伤修复基因A P E l 在宫颈癌中的表达及其与锎．2 5 2 中子放疗预后的关8第三军医大学博士学位论文系：采用采用免疫组化方法A P E l 在宫颈癌中的表达情况，分析A P E l 与宫颈癌的临床病理因素及锎．2 5 2 中子放疗的预后的关系；2 ．诱导并建立放射线照射耐受株：应用直线加速器和锎。

2 5 2 中子后装治疗机对宫颈癌H e l a 细胞株进行剂量个体化的反复放射线照射，剂量呈梯度增加，最后使其耐放射性具有一定的稳定遗传能力，建立耐中子射线细胞株H e l 州R 和耐x 射线细胞株H e l a X R ，并通过克隆形成分析、超微结构观察、细胞倍增时间、细胞周期分布和凋亡这些指标检测其耐放射特性3 ．耐放射宫颈癌细胞株D N A 损伤修复相关差异表达基因的筛选：采用D N A 损伤信号通路基因芯片( O H S 一0 2 9 ) 检测H e l a 、H e l a N R 和H e l ⅨR 细胞的基因表达谱，分析其差异表达基因，并采用w e s t e mb l o t 和R e a l ．t i m eP C R 技术验证基因芯片结果的可靠性4 ．G A D D 4 5 a 表达载体增强宫颈癌放疗敏感性的初步实验研究：构建特异性p c D N A 3 ．1 ．G A D D 4 5 n 真核表达载体，R e a l —t i m eP C R 检测转染后宫颈癌细胞G A D D 4 5 仅m R N A 表达情况，流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况研究结果1 ．D N A 损伤修复基因A P E l 在宫颈癌中的表达及其与锎一2 5 2 中子放疗预后的关系：宫颈癌组织A P E l 表达水平明显高于正常宫颈组织和C 玳病例( P 0 ．0 5 ) ，转染组的细胞凋亡率明显高于对照组和脂质体组，它们之间有显著性差异( 尸 2m o n t h sa f 纪rt h el a s tr a d i a t i o nt r e a t m e n t ．( 3 ) T h ec e Ud o u b l i n gt i m e so ft h eH e l a N Ra n dH e l a X Rc e l l s( 3 3 ．1 2 ±3 ．6 7h ，a n d3 6 ．9 4 ±3 ．1 6h ，r e s p e c t i V e l y ) w e r el o n g e rt h a nt h o s eo ft h ep a r e n tH e l ac e l l s ( 2 8 。

6 2 ±2 ．7 7h ) ．( 4 ) I I lH e l ac e l l s ，e x p o s u r et oar a d i a t i o nd o s eo f4G ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ep r o p o r t i o no fc e U si nG 2a n dd e c r e a s e dt h ep r o p o r t i o no fc e l l si nG1 ．T h ep r o p o n i o no fG 2 一a 1 1 r e s t e dH e l ac e U sw a se V e ng r e a t e rf b l l o w i n gl6 一G yi r r a d i a t i o n ．I I lt h eH e l a N Ra n dH e l a X Rs u b —l i n e s ，h o w e v e r ，t h ep r o p o n i o no fc e l l si nG 2d i dn o ti n c r e a s ea f t e ri r r a d i a t i o nw i t h4G y ．A tl6G y ，c e l l so fb o t hs u b —l i n e sb e c a m ea r r e s t e di nG 2b u tt h ep r o p o n i o nw a sm u c hl o w e rt h 柚i nH e l ac e l l s ．T h u s ，c e l l so ft h er a d i o r e s i s t a n ts u b ·l i n e s5第三军医大学博士学位论文p r o b a b l ya r r e s t e di nt h eGlp h a s eo ft h ec e l lc y c l e ．( 5 ) A t0G y ，t h e 印o p t o s i sr a t ew a sO ．9 3 —2 ．7l ％f o ra l lt h r e ec e Ul i n e s ．A t4 加d16G y ，t h ea p o p t o s i sr a t eo fH e l ac e U sw a sm u c hh i g h e rt h a nt h a to ft h er a d i o r e s i s i t a n ts u b —l i n e s ( 4 G y ：9 ．3 2 坩3 ．8 4 ，7 ．9 4 坩5 ．4 3 ；16 G y ：2 2 ．4 7 坩7 ．2 8 ，2 0 ．0 3 坩1 1 ．1 ，p O ．0 5 ) ．C ：o n c l u s i o n1 ．T h ed y s t o p i ce x p r e s sO fA P El“g h tp l a yap i V o t a lr o l e i nc a r c i n o g e n e s i sa n dp r o g r e s s i o no fc e n ，i c a lc 锄c e r ，锄dt h ee x p r e s so fA P E1m i 曲te s t i m a t et h ep r o g n o s i sa f t e r2 5 2 C fr a d i o t h e r a p y ．I ts h o w e dt h a tt h eD N Ad a m a g er e p a i rf u n c t i o no fA P Elm i g h tc o n ．e l a t ew i t hr a d i o r e s i s t a n c ei nc e r v i c a L lc a n c e r ．2 ．H e l ac e U sw e r ei 1 1 r a d i a t e dw i t hf } a c t i o n a t e d2 5 2 C fn e u t r o na n dX ．r a y s ，y i e l d i n gt w or a d i o r e s i s t a n tc e l ls u b —l i n e sH e l 刑Ra n d H e l a X R ．T h er a d i o r e s i s t a n ts u b —l i n e sw e r em o r er a d i o r e s i s i t a n tt op a r e n t a lH e l ac e l l sb yd e t e c t i n gt h e i rr a d i o r e s i s t a n tc h a r a c t e r i s t i c s ．3 ．M i c r o a l l r a ya n a l y s i sw a su s e dt oi d e n t i f yt h eg e n ee x p r e s s i o np a t t e m so ft w or a d i o r e s i s t a n ts u b —l i n e sd e r i v e df r o mH e l ac e l l s 锄dt h ed i f f - e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sr e l a t et oD N Ad a m a g er e p a i rg e n e si nc e r v i c a lc a n c e rw e r es e l e c t e d ．I ts u p p o r t e dt ol o o kf o r t h et a 唱e t so fi m p r o V i n gr a d i o s e n s i t i V i t yi nc e r V i c a lc a n c e r ．4 ．T h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro fG A D D 4 5 0 【g e n ew a sc o n s t r u c t e d ．T h ee x p r e s s i o no fG A D D 4 5 am R N Aa n dr a d i a t i o n - i n d u c e da p o p t o s i si n c r e a s e ds i g n i n c a n t l ya f t e re u k a r y o t i ce x p r e s s i o nV e c t o ro fG 。