依达拉奉改善大鼠血脑屏障损伤的AQP 4机制研究.doc

依达拉奉改善大鼠血脑屏障损伤的AQP 4机制研究【摘要】 目的研究大鼠脑出血后血脑屏障(BBB)通透性与水 通道蛋白4(且quaporin 4, AQP 4)的关系及依达拉奉的干预作用方法 采用自体动脉血注入尾状核法制成大鼠脑出血模型，免疫组化法观察AQP4的表达，伊文思蓝法测BBB的通透性，干湿重法计算脑含水量表示脑 水肿结果 与对照组相比，模型组及依达拉奉组BBB通透性均在出血后 6h开始升高，1〜3d最高，依达拉奉组明显小于模型组(P< ;0. 01) o 2组 AQP 4也于6h开始升高，1〜3d达到高峰依达拉奉组明显小于模型组 (P<0.05) o BBB通透性与AQP 4表达呈显著正相关(r二 0. 880, P<0.01),与脑水肿变化趋势一致结论 脑出血后产生的AQP 4增多，从而增加BBB通透性，参与脑水肿形成和发展，依达拉奉可抑制AQP4的表达，从而有减轻脑水肿的作用关键词】脑出血；脑水肿；血脑屏障;AQP 4;依达拉奉[Abstract] Objective To investigate the relationship between blood brain spinal fluid barrier (BBB) permeability and aquaporin4 (AQ卩 4)and the effect of edavarone after experimentalintracerebral hemorrhage (ICH) in rats・Methods The ICH model were established by stereotaxic injection of autologous artery blood4 expression byinto caudate nucleus to detect AQPi mmunoh i st ochemi cal met hod, BBB permeabi 1 it y by EB method and brain water contents by dry wet weight method・ Results In contrast to the controlled group, BBB permeability increased at 6 hours in ICII group and edavarone group after TCH, reached peak at 1 〜3 days, and which in edavarone group was lower than that in ICH group (P<0.05). Edavarone expression increased at 6 hours in two groups reached peak at 3 days , and which in edavarone group was lower than that in I CH group (P<0.05). There was a significantly positive correlation bet ween AQ 卩 4 expression and BBB permeabi lity (r 二 0.880, 卩&It;0・01)・Conclusion After ICH AQP 4 expression up regulate and BBB permeability increase, which could be inhibited by edavarone[Key words 1 Cerebral hemorrhage; Cerebral edema; AQP4; Blood brain spinal fluid barrier; Edavarone脑出血(intracerebral hemorrhage, ICII)脑水肿是影响患者病情 程度及预后的重要因素,而后期血脑屏障损伤引起的血管源性脑水肿是主 要的原因。

由于伊文斯蓝具有不能透过血脑屏障的特性，本实验以检测脑 组织中伊文斯蓝(EB)含量来分析脑出血后血脑屏障和AQ卩4的关系，进 一步探讨依达拉奉改善脑出血大鼠血脑屏障损伤的AQP 4机制1材料与方法1. 1实验动物 成年s D雄性大鼠90只，由新乡医学院动物实验 中心提供，体质量280~300go标准饲料喂养和自由饮水，保持室温20〜 25°C及恒定的湿度按数字表随机分为对照组、模型组、依达拉奉组各30 只每组在随机分为术后6h、Id、3d、5d、7d 5个时相点，每个时相点 下6只1.2实验方法（1）模型组：以4%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉参 考Hua等［1］方法固定大鼠头正中切约lcni的纵切口，暴露前凶，使微 量注射仪套管尖端移至前囱前0. 5mm,左侧中线旁3mm,用大针头钻孔, 穿透颅骨用4CTC水温浴鼠尾约lOmin取出擦干，在距鼠尾末端约5mm 处剪断，用微量注射仪吸新鲜血液约50m 1,迅速插入钻好的孔内，向内 进针6111111在2. 5min内注入，留针5inin后缓慢退针拔针后无血液自针 道返流，苏醒后出现神经功能缺损症状视为造模成功2）对照组：前期 操作同模型组，但不注血液。

3）依达拉奉组：建模前每隔12h腹腔注射 依达拉奉2mg/kg直到相应的时相点，对照组及模型组用等量的生理盐水腹 腔注射1. 3检测方法1.3.1干鲜质量的测定：取血肿中心前半分区脑组织，准确称重置于100〜110°C的烤箱中烘烤24 h至恒重后,称取干质量，根据公式：脑组织含水量(%)二(鲜质量-干质量)/鲜质量来计算，精确度为0・11.3.2血脑屏障通透性测定：采用伊文思蓝甲酰胺法，大鼠处死前1 h经尾静脉注入2% EB (2ml/kg),称取血肿内侧部分置于甲酰胺 (lml/100g脑组织)中60°C孵育24ho 1000 r/ min ,离心5min,分光光度 计(入二632nm)测定上清液0D值,根据标准曲线计算出EB含量1.3.3 AQP 4免疫组化检测：常规脱水,加一抗AQP 4(1 : 50), 加生物素标记山羊抗兔TgG,脱片,显微镜下观察棕黄色为强阳性,黄色为 阳性，浅黄色为弱阳性,与间质颜色一致者为阴性随机采集5个高倍视野 (10X40),采用双盲法计算每个高倍镜视野AQP 4阳性细胞表达率1.4统计学分析 实验数据计量资料均以土s表示，应用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行处理。

多组间比较采用单因素方差分析检验，变量 之间做两两的直线相关分析，P<O. 05差异有统计学意义2结果见表1、2、3、4表1脑出血后不同时间点脑含水量注：与假手 术组比较，*P<O. 05;与ICH组同一时间点比较，#P<O. 05表2脑出 血后不同时间点脑组织EB含量表3脑出血后不同时间点脑组织AQP 4 表达含量 表4 EB含量与AQP 4表达的相关分析注：相关性检验,*P<0.01 ;表格数值为相关系数r值3讨论AQP 4是近年来研究比较多的一类水特异性膜内在蛋白，为水分 子跨膜转运提供了一个全新的分子结构棊础，对于维持机体的水平衡起着 重要作用，并且与水平衡紊乱所造成的一些疾病有密切关系［2］AQP 4 广泛存在于中枢神经系统的星形胶质细胞膜、蛛网膜下腔、血管周围的胶 质细胞、室管膜细胞、脉络从及下丘脑渗透压感受区器官，并认为其在中 枢神经系统作为渗透压感受器有介导和调节水的运输和平衡的作用在生 理条件，水通道基本上是处于激活状态，水转运过程很快，一般不需门控 和其他调节，而在脑出血后6 h,水肿区的阳性细胞数增多，阳性细胞体 积增大，AQP 4表达增强，第3天达高峰，此后逐渐冋落，但1周后仍 明显高于正常。

已有研究表明，AQP 4不仅参与脑组织水代谢的生理和 病理过程，而且可能与调节脑脊液的形成及细胞外液容积的变化有关，参 与脑水肿的多种生理、病理过程发生脑水肿时AQP 4表达增加，是星形 胶质细胞适应细胞外环境变化的反应，同时AQP 4又促进了星形胶质细 胞水肿的发生和发展，而AQP 4表达的下调或缺陷对减轻脑水肿程度、 降低病死率和致残率有重要作用这显示AQ卩4在脑组织水的运输中起 关键性作用，且提示调节AQP 4变化可能为减轻各种脑疾病所致脑水肿 提供新的治疗方法脑出血后脑水肿主耍是血脑屏障受损，通透性增加，血浆渗出引起 的血管源性脑水肿本实验显示脑出血后血浆中AQP 4的浓度出现了明 显的增高，随着AQP 4含量的增高，脑水肿也随之明显加重，到72h达 高峰表明AQP 4的大量产生与脑水肿发生之间有一定的关系本实验 结果还显示，脑出血后AQP 4的浓度从6h逐渐增高，脑水肿的变化趋势 与之大致相同，5d达峰值,7d开始下降脑出血组脑组织EB含量在脑出 血后6h上升，1〜3d达到高峰后缓慢下降，Id与3d相比无显著性差异 (P>0. 05),推测BBB通透性的高峰出现在1〜3d。

BBB通透性与AQP 4表达的相关分析显示二者呈显著正相关,表明脑出血后AQ卩4表达的上 调可能引起BBB的开放，使BBB通透性增加脑含水量在脑出血后6h也开 始升高,3d达到高峰，之后开始下降,7d仍然高于正常，与AQP 4表达的 变化一致，二者呈显著正相关，与文献报道一致脑出血后AQP 4表达水平和脑含水量在相应时间点上均高于对照组，提示AQP 4表达的上调导致脑含水量的增加，说明AQ卩4与脑出血后脑水肿的形成有密切关系 本实验中依达拉奉组与出血组相比,BBB通透性高峰出现的时间趋于一致, 但峰值明显降低,其他时间点脑组织内EB含量也低于脑出血组，表明依达 拉奉能显著降低BBB的通透性，依达拉奉组AQP 4表达及脑含水量在各 时间点均低于脑出血组,说明应用依达拉奉能够降低脑出血后脑内AQP 4 的表达及脑含水量自由基清除剂依达拉奉是目前临床试验证明惟一有效的自由基清除剂[3],具有口由基清除和抑制脂质过氧化的作用，可以抑制脑细胞(血 管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，静脉给药后可清除脑内的具有高 度细胞毒性的疑基基团体内试验显示[4],依达拉奉还能抑制血管内皮 细胞损害，抑制脑水肿、改善神经功能。

参考文献】[1] Hua Y, Schallert T, Keep RF, et al. Behavioral test after intracerebral hemorrhage in the rat [J]・ Stroke, 2002, 33 (10): 2 478 2 484.[2] Kiening KL, Frank KH, Landeghem V, et al. Decreased hemispheric aquaporin 4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats [J].Neuroscience Letters, 2002, 324(2):105 108.[3] 渡边俊明，幸敏志，齐藤健一，等•新规脑保护药MCI 186药 理学的检讨[J]・药理与治疗，1997, 25(suppl7) :S181 S188.[4] 陈勇，高朴，常娜，等•依达拉奉治疗脑出血的临床疗效观察[J]・中国实用神经疾病杂志，2008, 11 (6)： 104 105.。