单克隆分离与挑选.docx

单克隆的分离与挑选1. 在正式开始工作前1-7天时间内准备好：将菌种mm294在LB琼脂培养基的平 板上划线，和将 mm294 /含氨苄西林抗性基因的菌种在 LB 琼脂和氨苄西林的培 养基的平板上划线将其在37 °C下培养过夜培养好后将平板，用封口膜或者 塑料膜包起来放置在4°C并干燥的环境中2. 实验准备:2 个 LB 琼脂平板2 个 LB 氨苄西林的平板3. 在平板的底部做上清晰的标记，（不要写在盖子上）4. 在37C下预热材料：培养的菌和平板 支持和仪器2 个 LB 琼脂平板 含有 10%漂白粉的垃圾袋2 个 LB 氨苄西林的平板 或者其他的消毒措施培养好的 mm294LB 琼脂平板 实验用煤气灯培养好的mm294/氨苄西林LB氨苄西林的平板 接种环记号笔平板划线技术：1. 在平板上写上你的标记和日期用记号笔，每个平板都预先写上 LB 琼脂或者 LB 琼脂+氨苄西林2. 选择两个LB琼脂平板，一个标记-PAMP（氨苄阴性）细菌不含质粒，另一个标记 +PAMP（氨苄阳性）细菌含质粒3. 选择两个LB琼脂+氨苄西林平板，一个标记-PAMP（氨苄阴性）细菌不含质粒，另 一个标记+PAMP（氨苄阳性）细菌含质粒。

4. 像握铅笔一样握住接种环，在灯上烧接种环，烧到环呈红热状态，然后继续烧 下半部分5. 放凉5 秒，不要把接种环放在试验台上避免被污染6. 大肠杆杆菌的一种划板技术从培养平板开始：a 用另一只手移动培养有 E Coli 的平板的盖子，不要将盖子放在试验台上，盖 子面朝下对着培养平板，防止污染物落入平板中b 把接种环在平板干净的地方刺几下使其冷却C 用接种环刮取一个可见的菌团作为一个克隆，不要刮烂琼脂层更换一个新的 培养皿盖，按照步骤 7 进行7. 选一个LB-PAMP平板，打开盖子一点一点，只要足够划线就可以划线 1：划动接种环的前端向琼脂层表面划线并使划线遍及平板的顶部， 避免划烂琼脂层划线 2：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离第一次的划线 接种环通过第一次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整 个平板表面的 1/4.划线 3：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前两次次的划线 接种环通过第二次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其约占整 个平板表面的 1/4，且锯状线不要再接触到前面划的线划线 4：重新烧接种环并使它通过刺入琼脂层变凉，要远离前三次的划线。

接种环通过第三次的划线（通过是不要抬起接种环），并画锯状线，使其仍然能 占到整个平板表面的 1/48. 重复4-7的过程，把E.coli接种到平板LB/amp, -PAMP （氨苄阴性）9. 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB，+PAMP （氨苄阴性）10. 重复4-7的过程，把E.coli/PAMP接种到平板LB/amp，+PAMP （氨苄阴性）11. 重新烧接种环，并使它冰凉后放在接种工作台上，最后一次使用要烧接种环， 保持这个好习惯12. 把平板颠倒放在37°C培养箱中，培养15-20h平板倒过来放是为了防止凝 结产生的水掉落在琼脂层上引起菌板移动）13. 选择达到预期效果的单克隆，培养了 15-20h这时单克隆的直径0.5mm-3mm 14卫生处理将废弃的菌，消毒处理。