响应面法优化亚临界水提取银耳多糖工艺研究.docx

响应面法优化亚临界水提取银耳多糖工艺研究 高丽萍　郑光耀　闫林林摘要：采用亚临界水提取技术提取银耳多糖，考察提取温度、提取时间、液料比对多糖提取得率的影响，结合响应面法优化其提取工艺，并与传统热水浸提法进行比较结果表明，亚临界水提取银耳多糖的最佳工艺条件为提取温度138 ℃、提取时间30 min、液料比30 mL/g，在该条件下银耳多糖提取得率可达34.58%与传统热水浸提法相比，银耳多糖的提取得率提高了84.23%，亚临界水提取法可明显缩短银耳多糖的提取时间和提高银耳多糖的提取得率关键词：银耳；多糖；亚临界水提取；响应面法优化： TS201.1 文献标志码： A ：1002-1302（2016）07-0339-04银耳是一种经济价值高、营养丰富的药食两用菌，具有润肺生津、滋阴养胃、补脑强心等功效我国是银耳生产大国，但目前市场上销售的银耳品种单一，绝大部分是未经任何加工的银耳干品，在一定程度上限制了银耳的消费银耳多糖是银耳的主要活性成分，具有提高机体免疫能力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变等作用，可广泛应用于功能性食品、医药保健品及日用化妆品等领域[1-4]银耳多糖的常用提取方法是热水浸提法，但这种传统的提取方法存在耗时长、提取率低、易造成资源浪费等问题。

银耳多糖分为胞外多糖和胞壁多糖，其中胞壁多糖存在于细胞壁内部，用热水浸提很难提取完全，即使是采用稀酸提取法或稀碱提取法，又由于部分多糖易发生水解，破坏多糖的活性结构，导致多糖损失和提取率降低亚临界水提取技术是近年来发展起来的一种新兴的提取技术，具有提取时间短、提取效率高、环境友好等技术优势，是一种很有开发潜力的绿色提取技术[5-7]本研究采用亚临界水提取银耳多糖，研究提取温度、提取时间、液料比对银耳多糖提取得率的影响，并结合响应面分析法优化银耳多糖的亚临界水提取工艺，提高银耳多糖的提取得率，旨在为银耳多糖的开发和利用提供依据1 材料与方法1.1 材料市购干燥的银耳子实体，经万能粉碎机粉碎后，得到过40目筛的银耳粉末，备用葡萄糖标准品；苯酚、浓硫酸均为分析纯；去离子水；UV-2102 PC型紫外-可见分光光度计；TGL-16C型高速台式离心机自制亚临界水萃取装置，如图1所示1.2 方法1.2.1 亚临界水提取 称取一定量的银耳粉末置于萃取罐的物料篮内，在不同提取温度、提取时间、液料比的条件下进行提取，亚临界水提液4 000 r/min离心10 min，测量上清液体积，测定银耳多糖含量，计算银耳多糖得率。

1.2.2 热水回流提取 称取一定量的银耳粉末置于圆底烧瓶内，按液料比60 mL/g加入去离子水，在100 ℃水浴锅回流提取6 h，提取液在4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定银耳多糖含量，计算银耳多糖得率1.2.3 多糖标准曲线制作 0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液：将葡萄糖干燥至恒质量后准确称取1.000 g，用去离子水溶解并定容至1 L，梯度稀释至0.1 mg/mL分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL葡萄糖标准溶液于20 mL比色管中，用去离子水补至2.0 mL；混合均匀后分别依次加入5%苯酚1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，摇匀；静置10 min放入沸水浴中反应15 min，水浴冷却至室温，490 nm处进行测量，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线1.2.4 多糖测定和计算方法 参考苯酚-硫酸法[8]测定多糖含量：准确吸取样品液1.0 mL，加水补充至2.0 mL，摇匀，加入5%苯酚1.0 mL，摇匀，再加5.0 mL浓硫酸，迅速摇匀室温放置5 min，在沸水浴中保温15 min，用自来水冷却 5 min，再摇匀，于波长490 nm处测定吸光度。

多糖得率计算公式如下：粗多塘得率=CV1N10-3V2m100%式中：C表示经过稀释后测定的多糖含量（μg）；V1表示提取后得到的上清体积（mL）；N表示稀释倍数；V2表示用于测定的上清体积（mL）；m表示用于提取的银耳质量（mg）1.2.5 响应优化法试验设计 在提取温度、提取时间、液料比3个单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的影响因子，以多糖提取得率为响应值作响应面与等值线图，分析优化最佳提取条件2 结果与分析2.1 单因素试验根据文献报道，在亚临界水提取过程中，压力只是用来使水保持液体状态[9]，所以本试验不考虑压力对多糖得率的影响，选择3 MPa作为提取压力，研究提取温度、提取时间、液料比3个因素对银耳多糖提取得率的影响2.1.1 提取温度的影响 在提取时间为20 min，液料比为60 mL/g的条件下，选取提取温度分别为100、110、120、130、140、150 ℃，对银耳多糖进行亚临界水提取由图2可知，随着提取温度的升高，多糖得率逐渐升高，100～130 ℃升高趋势明显，到达130 ℃后再提高温度，多糖得率有下降趋势。

因此，选取130 ℃作为后续的亚临界水提取温度2.1.2 提取时间的影响 在提取温度为130 ℃，液料比为60 mL/g条件下，选取提取时间分别为10、20、30、40、50 min对银耳多糖进行亚临界水提取由图3可知，在10～20 min内，多糖得率会随着提取时间的延长而增加，继续延长提取时间，多糖得率变化并不明显因此，选取20 min作为后续的亚临界水提取时间2.1.3 液料比的影响 在提取温度130 ℃，提取时间20 min条件下，选择液料比为20、30、40、50、60 mL/g对银耳多糖进行亚临界水提取由图4可知，多糖得率随液料比的增大而增加，当液料比在20～40 mL/g之间时，多糖得率增加较快，继续提高液料比多糖得率并没有增加因此，选取40 mL/g作为后续的亚临界水提取液料比 2.2 响应面分析法优化工艺2.2.1 多糖提取试验方案和因素水平 响应面分析法已经被广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等领域[10]根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，选取提取温度、提取时间、液料比对银耳多糖亚临界水提取得率影响显著的3个因素，采用三因素三水平响应面分析方法进行试验设计（表1）。

2.2.2 响应面分析方案及结果 对银耳多糖亚临界水提取工艺进行响应面分析，具体试验方案见表22.2.3 模型的建立及其显著性检验 运用Design-Expert 8.0.6 软件对表2的试验数据进行多元回归拟合，得到银耳多糖得率（y）对提取温度（x1）、提取时间（x2）和液料比（x3）的二次多项回归模型为：y=28.46+3.80x1+0.19x2-1.85x3+0.53x1x2-2.96x1x3-2.00x2x3-4.54x12+216x22-3.35x32运用Design Expert软件对17个试验点的响应值进行回归分析，得到回归分析表（表3），对多糖提取得率有交互影响的响应面分析立体曲面图见图4至图6模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察当P值显著在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，其顺序为提取温度>液料比>提取时间2.2.4 因素间的交互影响 由图5可以看出，若液料比固定不变，提取温度与提取时间的交互作用对银耳多糖得率的影响显著，多糖得率随提取温度及提取时间的增加而呈现由低到高再降低的趋势，即多糖得率在合适的提取温度及提取时间下具有极大值，该极大值存在于响应曲面的顶部，即响应面的最高点，也是等高线最小得椭圆的中心点。

由图6可知，若提取时间固定不变，提取温度与液料比的交互作用对多糖得率的影响显著，多糖得率随提取温度及液料比的增加而呈现由低到高再降低的趋势，即多糖得率在合适的提取温度及液料比下具有极大值，该极大值存在于响应曲面的顶部，即响应面的最高点，也是等高线的最小得椭圆的中心点由图7可知，若提取温度固定不变，提取时间及液料比之交互作用对多糖得率的影响显著，多糖得率随提取时间及液料比的增加而呈现由低到高再降低的趋势，即多糖得率在合适的提取时间及液料比下具有极大值，该极大值存在于响应曲面顶部，即响应面的最高点，也是等高线最小得椭圆中心点提取温度与液料比对银耳多糖提取得率的交互效应最为显著，表现为曲线较陡；提取温度与提取时间对银耳多糖提取得率的交互效应次之；提取时间与液料比对银耳多糖提取率的交互效应不显著，相应表现为曲线较为平滑2.2.5 优化最佳组合条件 通过上述分析可知，合适的提取温度、提取时间和液料比有利于银耳多糖的提取，因此可以采用软件优化功能或者利用二次方程模型分别对参数Xi求导，联解求导所得的方程，即可得到最佳试验条件本试验采用软件Optimization的Numerical优化功能，在试验因素取值范围内选择最低点为出发点，响应值选取最大值，可优化得到亚临界水萃取银耳多糖的理论最佳条件，即最佳提取温度 137.8 ℃，提取时间30 min，液料比 30.81 mL/g，在此条件下，银耳多糖提取得率的理论预测值为34.26%。

考虑到实际操作的便利性，将银耳多糖的最佳提取条件修正为提取温度138 ℃、提取时间30 min、液料比30 mL/g2.3 验证试验为检验RSM优化法的可靠性，采用上述最优提取条件进行银耳多糖亚临界水提取试验，实际测定银耳多糖的提取得率为34.58%，与理论预测值34.26%误差约0.9%左右，证明响应面法适用于对银耳多糖亚临界水提取工艺进行回归分析和参数优化，具有较高的实用价值2.4 亚临界水提取法与传统热水浸提法的比较从表4可以看出，亚临界水提取法在提取温度138 ℃、提取时间30 min、液料比30 mL/g条件下，银耳多糖提取得率为34.58%利用传统热水浸提法[11]，在提取温度为100 ℃、提取时间 6 h、液料比 60 mL/g条件下，银耳多糖提取得率仅为18.77%由此可知，亚临界水提取法可明显降低银耳多糖的提取时间并提高银耳多糖提取得率3 结论采用亚临界水提取技术提取银耳多糖，通过单因素试验对该方法影响多糖提取得率的主要因素提取温度、提取时间、液料比进行了研究，并在此基础上采用三因素三水平响应面分析法进行了试验，获得亚临界水提取银耳多糖的最佳工艺条件为提取温度138 ℃、提取时间30 min、液料比30 mL/g，此时银耳多糖提取得率为34.58%。

亚临界水萃取法与传统热水浸提法相比，银耳多糖的提取得率提高了84.23%，结果证实亚临界水提取法具有提取时间短、提取效率高等优点，是一种有效的银耳多糖提取技术参考文献：[1]Baets S D，Vandamme E J. Extracellular tremella polysaccharides：structure，properties and applications[J]. Biotechnology Letters，2001，23（17）：1361-1366.[2]Wasser S P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J]. Applied Microbiology Biotechnology，2002，60（3）：258-274.[3]黄秀锦. 银耳多糖的提取、分离、纯化及其功能性质研究[J]. 食品科学，2008，29（1）：134-136.[4]Yan Y L，Yu C H，Chen J，et al. Ultrasonic-assisted extraction optimized by response surface metho。